【摘 要】
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目的 构建基于柯萨奇病毒-A5（Coxsackievirus-A5,CV-A5）复制子的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2）Delta突变株（B. 1.617.2）自扩增RNA（self-amplifying RNA,saRNA）疫苗，并评价其免疫原性。方法 以含有CV-A5全长基因组序列
【基金项目】
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国家重点研发计划（2020YFC0842100）；
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目的 构建基于柯萨奇病毒-A5（Coxsackievirus-A5,CV-A5）复制子的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2）Delta突变株（B. 1.617.2）自扩增RNA（self-amplifying RNA,saRNA）疫苗，并评价其免疫原性。方法 以含有CV-A5全长基因组序列的质粒为基础，通过In-fusion克隆将SARS-CoV-2Delta突变株S蛋白基因替换不同长度的CV-A5 P1结构蛋白基因，分别构建重组质粒pDelta-S10、pDelta-S5和pDeltaS1（融合多聚蛋白的S-VP1/2A酶切位点上游的氨基酸分别为10、5和1个）。通过线性化重组质粒体外转录获得3种RNA分子Delta-S10、Delta-S5和Delta-S1。将3种RNA分子分别转染HEK-293T细胞，Western blot分析S蛋白的表达，筛选出S蛋白表达量最高的RNA分子，qPCR检测其在HEK-293T细胞中的自扩增。将筛选出的Delta-S用脂质纳米颗粒包装后，通过肌肉注射方式，采用两种剂量（0.5和2.5μg）免疫BALB/c小鼠（雌性，6～8周龄，每组5只），于第1和14天各免疫1次，第14和28天采血，ELISA法检测血清结合抗体滴度，微量中和法检测中和抗体滴度；第42天摘取脾脏，酶联免疫斑点技术（enzyme linked immunospot assay,ELISPOT）检测小鼠脾细胞分泌IFNγ水平。结果构建的重组RNA分子S蛋白表达量最高的为Delta-S10，其可在HEK-293T细胞中进行自扩增。Delta-S10高低剂量组均可诱导小鼠产生抗SARS-CoV-2 Delta S1蛋白特异性结合抗体，且剂量效应和加强免疫效应明显；Delta-S10高剂量组可诱导小鼠产生中和抗体，且可在小鼠体内诱导细胞免疫应答。结论 成功构建了基于CV-A5复制子的SARSCoV-2 Delta突变株（B. 1.617.2）saRNA疫苗Delta-S10，其可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，为肠道病毒复制元件构建新冠saRNA疫苗的深入研究奠定了基础。
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