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摘要：根据已报道的14个cry1Ca基因，设计能够扩增cry1Ca全长基因的简并引物。利用该引物对本实验室分离的472株Bt菌株进行筛选。PCR扩增发现22株菌含有cry1Ca基因。对22株菌株进行cry基因多样性分析，结果获得5种类型酶切图谱，表明这些菌株分为5种类型。SDSPAGE结果显示22株菌均表达约130 ku的蛋白。Western Blotting结果证实这些株菌中cry1Ca基因均正常表达。提取菌株的晶体蛋白，经胰蛋白酶活化，对甜菜夜蛾[Spodoptera exigua（Hübner）]进行初步生测，结果表明22株菌中活化的Cry蛋白对甜菜夜蛾均表现出很强的毒杀作用。进一步从5个类型的菌中各挑选一株毒力较高的菌株进行LC50的测定，结果证实它们均具有很高毒力，其中，T1E12（0.087 μg/g）、B16C8（0.103 μg/g）、T1B8（0.202 μg/g）的活性与阳性对照菌株G03（0.090 μg/g）相当，具有生产应用潜力。本研究为新型高效Bt菌株的挖掘奠定了基础。
关键词：苏云金芽胞杆菌； cry1Ca基因； 甜菜夜蛾； 致死中浓度
中图分类号： S 476.11
文献标识码： A
甜菜夜蛾[Spodoptera exigua（Hübner）]属鳞翅目夜蛾科，作为一种世界性的多食性害虫，长期为害包括棉花、番茄、大豆等在内的重要经济作物[1]。在中国，甜菜夜蛾的为害程度日趋严重，给农业生产造成巨大损失[2]。由于化学杀虫剂的滥用，已导致害虫抗性上升、环境污染等严重后果。因此，亟待加强Bt等生物农药的研究和利用。
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），是一种能够特异性毒杀害虫的革兰氏阳性细菌，杀虫活性主要由cry基因所编码的杀虫蛋白起作用[3]。由于Bt杀虫蛋白具有对靶标害虫特异性毒杀以及对非靶标生物如小鼠、人等哺乳动物安全、无毒害等特点[45]，已经成为世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂[67]。1988年第一个cry1Ca基因被克隆，1990年Honée首次报道了这个cry1Ca基因表达产物对甜菜夜蛾具有高毒杀作用[8]。迄今为止，全球已有14个cry1Ca基因公布，来自我国的cry1Ca基因数量达到8个（Bt杀虫蛋白国际命名委员会网站—http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）。国内多家单位先后筛选出对甜菜夜蛾高毒力的Bt菌株，如S184[9]、WY190[10]和Hcy系列[11]、CZE99985[12]、G03[13]等菌株。
本实验室在前期筛选对甜菜夜蛾高毒力菌株的基础上[14]，继续加大力度，采用菌株分型结合PCRRFLP技术，选取了已报道对甜菜夜蛾具有高毒力的cry1Ca基因[8，1516]作为切入点，对我们近两年新分离的Bt菌株进行活性筛选与基因鉴定，发掘对甜菜夜蛾具有高效杀虫活性的菌株，发现了一批高毒力菌株，这些菌株的共同特点就是都含有cry1Ca基因。本研究为高效毒杀甜菜夜蛾的Bt菌株的发掘与利用创造了条件。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 研究菌株来源
472株野生Bt菌株为本实验室从国内土壤中分离、筛选并保存。
阳性对照菌株：HD1Ca7（cry1Ca7基因转入HD 73-工程无晶体突变株），以及G03野生Bt菌株，含有cry1Aa、cry1Ac、cry1Ca、cry2Ab基因，是由河北农林科学院植保所分离，对甜菜夜蛾等夜蛾科害虫具有高毒力。
1.1.2 培养基
液体LB培养基：胰蛋白胨 1%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1%，pH调至7.0，121 ℃灭菌20 min。
液体1/2 LB培养基：胰蛋白胨 0.5%，酵母抽提物 0.25%，NaCl 0.5%，调pH至7.0，121 ℃灭菌20 min。
1.1.3 试虫及人工饲料来源
甜菜夜蛾试虫由武汉科诺生物科技股份有限公司提供；甜菜夜蛾试虫人工饲料由中国农业科学院植物保护研究所棉花害虫组提供。
1.1.4 主要生化试剂
引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；核酸聚合酶、限制性内切酶以及标准DNA、蛋白marker购自大连TaKaRa宝生物工程有限公司；胰蛋白酶（1∶250）购自北京索莱宝生物科技有限公司；第一抗体：小鼠来源单抗，购自美国一龙（Envirologix）公司；第二抗体：HRP标记的羊抗鼠单抗，购自美国Sigma公司；显色液：SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate试剂盒购自Thermo Scientific公司。
1.2 试验方法
1.2.1 cry1Ca基因简并引物设计
通过从Bt杀虫蛋白国际命名委员会网站—http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/网址查询获得目前已报道的cry1Ca第4等级基因共有14个，除cry1Ca10、cry1Ca14外的12条基因编码序列能够通过GenBank登录号从NCBI上下载；将12条基因序列进行多序列比对，设计出能够扩增cry1Ca基因全长的简并引物。
设计引物序列，上游引物5′ATGGAGGAAAATAATCAAAATC3′，下游引物5′ATTASTCCTTATGGAGGAATAA3′。
1.2.2 Bt菌株基因组DNA的提取
基因组DNA提取参考张彦蕊等[17]的方法。
1.2.3 Bt菌株cry1Ca基因鉴定 对472个基因组进行分组，以5～7个菌株基因组混合作为一组模板，利用cry1Ca基因简并引物首先进行第一轮PCR扩增，然后对能够扩增出信号的混合基因组再分别进行第二轮筛选，最终确定到菌株。
PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3.5 min，30次循环；72 ℃延伸10 min。
PCR反应体系：2×PCR Taq Mixture 10 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，超纯水7 μL，总计20 μL体系。
1.2.4 cry1Ca基因的扩增、克隆与测序分析
包括Cry1Ca原毒素在内的所有130 ku Cry蛋白都包含一个位于N末端、600氨基酸的活性区域[18] （C末端与杀虫作用无关）。因此从基因的5′端到约2.2 kb设计引物，利用PrimeStar高保真聚合酶扩增，产物连接载体送测序。设计引物序列：上游引物5′ATGGAGGAAAATAATCAAAATC3′，下游引物5′AATTAAAAGCTTATACCCGT3′。
PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35次循环；72 ℃延伸10 min。
PCR反应体系：2×PrimeStar 10 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，超纯水7 μL，总计20 μL体系。
测序交由北京擎科新业生物技术有限公司完成。
1.2.5 菌株晶体形态观察
利用1/2 LB培养基对供试菌株培养30 h，BX 63显微镜（日本Olympus）进行100×油镜观察并拍照，具体方法参见文献[19]。
1.2.6 菌株cry基因多样性分析
采用PCRRFLP技术对筛选出的野生菌株进行cry基因类型的多样性分析；简并引物及PCRRFLP流程参考束长龙建立的方法[20]。该对简并引物是作者根据多类cry基因的保守区同源序列经过聚类分析所设计，利用HinfⅠ限制性内切酶对扩增产物进行酶切，能够展示出不同带型的酶切图谱，有助于对不同Bt菌株的cry基因组成进行差别鉴定。
参考引物序列：上游引物con_1f序列5′TATGCWCAAGCWGCCAATYTWCATYT3′，下游引物con_5r序列5′GGRATAAATTCAATTYKRTCWA3′。
PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，38 ℃退火2 min，72 ℃延伸2 min，30次循环；72 ℃延伸10 min。
PCR反应体系：2×PCR Taq Mixture 15 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，超纯水12 μL，总计30 μL。
PCR酶切体系：PCR产物10 μL，酶切缓冲液3 μL，HinfⅠ 1 μL，超纯水16 μL，37 ℃反应2 h。
1.2.7 Cry蛋白提取、胰蛋白酶消化以及定量
菌株Cry蛋白提取采用1/2 LB液体培养基、重复溶解的方法进行提取，具体详见Zhou等的方法[19]。菌株提取Cry蛋白的SDSPAGE分析参考萨姆布鲁克等[21]的方法进行；并以1.0 μg（浓度为0.2 mg/mL）牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白进行条带定量，定量采用图像分析软件（Image J）测定电泳条带灰度值，并根据标准BSA浓度计算Cry蛋白浓度。参考Bravo文献[22]选择胰蛋白酶（1∶250）对提取的Cry蛋白进行消化：按照质量比1∶10（胰蛋白酶∶Cry蛋白质）加入胰蛋白酶，37 ℃下消化2 h，继而对消化蛋白条带进行SDSPAGE分析、定量。
1.2.8 Western Blotting对筛选菌株cry1Ca基因表达检测
对供试菌株所提取Cry蛋白的消化产物进行10% SDSPAGE电泳：2块凝胶重复，其中1块作为平行胶进行考马斯亮蓝染色，另一块用于Western Blotting分析。利用eBlot快速转印仪（中国Genscript）10 min将胶上蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉（1×TBST溶解）室温封闭2 h；1×TBST漂洗3次，每次10 min；加入TBST稀释的鼠抗Cry1Ca蛋白单克隆抗体（1∶1 000），室温孵育1 h；1×TBST漂洗3次，每次10 min；加入HRP标记的羊抗鼠二抗（1∶2 000），室温孵育1 h；1×TBST漂洗3次，每次10 min；膜上加显色液，利用ImageQuant LAS 4000 mini凝胶成像仪（美国GE Healthcare）进行曝光、拍照。
1.2.9 甜菜夜蛾杀虫活性的测定
甜菜夜蛾杀虫活性的初步测定：处理组样品为所筛选22株野生Bt菌株、对照菌株G03、HD1Ca7菌株提取的Cry蛋白，共计24组；添加一定比例胰蛋白酶的50 mmol/L Na2CO3（pH=10.0）溶液设立为阴性对照组。按照10 g/重复称取人工饲料分别置于规格为60 mm的培养皿中，分别加入1 mL待测样品溶液，并将其充分混合均匀。每处理组设初始浓度70 μg/g、1/10初始浓度7 μg/g，每个浓度2个重复，每重复接初孵试虫30头。完成分装并放置于26 ℃光照培养箱（光周期L∥D=12 h∥12 h）进行为期7 d的培养。每天检查培养箱内温度、相对湿度及饲料是否变质；到期分别调查试虫死、活虫数目，统计并计算校正死亡率[23]。校正死亡率计算公式如下：
校正死亡率（%）=[（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）]×100%。
菌株LC50 值测定：选择对照菌株G03、HD1Ca7菌株以及经PCRRFLP分析、cry基因组成有差异的菌株进行复筛；LC50梯度设立6.000、2.000、0.667、0.222、0.074、0.025 μg/g共6个浓度，每个浓度3个重复，每重复接30头初孵试虫，其他流程同初筛。参考Vincent[24]的方法，利用SPSS 13.0软件进行LC50值的计算。 2 结果与分析
2.1 含有cry1Ca基因菌株鉴定与测序分析
利用所设计引物对472个提取的野生Bt菌株基因组进行PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳，最终筛选发现22株野生Bt菌株能够扩增出大小为3 570 bp的明显条带（图1）。测序结果同已知的cry1Ca基因进行比对，结果发现22条基因5′端到约2.2 kb序列同cry1Ca7基因的活性区域序列完全相同。
2.2 菌株晶体形态观察
对22株Bt菌株进行光学显微镜晶体形态观察，发现这22株菌株晶体均呈现出与参照菌株G03一致的双锥体形（图2）。
2.3 利用PCRRFLP对筛选菌株进行cry基因多样性鉴定
利用该对简并引物对22株野生菌株进行PCR扩增，结果显示从这些菌株基因组中均能够扩增出一条大小约为1.4 kb的明显条带（图3a）；继而对扩增的1.4 kb条带进行HinfⅠ限制性内切酶酶切，经2%琼脂糖凝胶电泳，结果展示出不同酶切图谱（图3b）。对酶切图谱条带数目以及大小进行分析，确定这22个样品酶切带型汇总为5类（图3c），其中类型1对应菌株为B16C8；类型2对应菌株为C12C8、T1A2、T1A5、T1D7、T1F10、T3C12、T3E10、T4C10、T5E8共9株；类型3对应菌株为T1B8；类型4为T1E12、T1F1、T2C8、T2D2、T2C12、T2D10、T3A8共7株；类型5为B15B4、T1E10、T1E9、T2C5共4株。G03菌株PCRRFLP结果（图3d），其酶切图谱与类型2相似。
2.4 Cry蛋白提取、消化、定量
对供试菌株提取的Cry蛋白进行SDSPAGE分析，结果显示菌株均表达分子量大小约为130 ku的蛋白（图4）。按照条带扫描情况计算出了Cry蛋白浓度；利用胰蛋白酶按照比例消化原毒素，图5是2 h消化结果，130 ku消失，蛋白条带集中于60 ku附近，并完成了消化条带的定量计算。
2.5 Western Blotting分析结果
利用Cry1Ca抗体对Cry蛋白消化产物进行Western Blotting分析，结果显示，样品在60 ku均获得较好杂交条带（图6 b），与Cry1Ca阳性对照一致。
2.6 甜菜夜蛾杀虫活性的测定结果
经定量计算的Cry蛋白消化产物，取终浓度为70、7 μg/g分别对甜菜夜蛾进行初步生测，结果说明供试菌株对甜菜夜蛾均有较高毒力（表1）；在70 μg/g浓度下，22株菌株校正死亡率在96%以上（19株菌同对照菌株G03、HD1Ca7，校正死亡率为100%），且存活虫体大小同初孵，无明显增长；7 μg/g浓度下，有18株菌校正死亡率在90%以上，3株菌校正死亡率在84%～90%之间，1株为75.4%。
根据初步生测活性结果并结合基因鉴定酶切图谱差异分析，从5个类型Bt菌株中各选取1株毒力高的为代表（B16C8、C12C8、T1B8、T1E12、T1E10）进行LC50测定；生测结果表明（表2），T1E12（0.087 μg/g）、B16C8（0.103 μg/g）、T1B8（0.202 μg/g）的活性很高，与阳性对照菌株G03（0.090 μg/g）相当；而菌株C12C8（0.610 μg/g）、T1E10（0.677 μg/g）的LC50接近，毒力分别比对照菌株G03低6.8倍和7.5倍。
3 讨论
70多年来，Bt菌株作为微生物杀虫剂已经取得了巨大的成功[6]。虽然Bt在生物农药中所占比例最高，但整个生物农药在农药中所占比重还非常小，因此针对甜菜夜蛾等重要害虫新型高效Bt菌株的挖掘仍然有很大的发展空间。
本研究以对甜菜夜蛾高毒力的cry1Ca基因鉴定入手，从472株野生Bt菌株中成功筛选到22株包含cry1Ca基因的野生Bt菌株，并通过Western Blotting分析证实了这些cry1Ca基因的表达。利用本实验室近期建立的、基于PCRRFLP技术进行菌株分型[20]，将这些菌株分为5种类型。在此基础上，筛选到T1E12、B16C8和T1B8三个菌株，它们对甜菜夜蛾幼虫的活性与阳性对照G03菌株相当。G03菌株是由河北农林科学院植物保护研究所在执行“八五”攻关项目期间分离获得的，对甜菜夜蛾、棉铃虫等夜蛾科以及小菜蛾、亚洲玉米螟等害虫具有高毒力。目前，该菌株已经作为受体菌构建了对鳞翅目、鞘翅目害虫的工程菌株，并于2014年12月获得农业部颁发的转基因生物生产应用证书[13]，正在进行农药登记。这3个高毒力菌株的获得，将丰富我国杀虫菌株资源，为新型Bt生物农药产业化奠定了基础。
cry1Ca第四等级基因自1988年到2015年共报道14个（其中由中国提交的基因有8个，占57.1%）；而cry1Ac第四等级基因从1985年到2015年，共报道发现38个（其中由中国提交的基因有16个，占42.1%）（Bt杀虫蛋白国际命名委员会网站http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/），cry1Ca基因的总数远低于cry1Ac基因。从基因鉴定的层面发现，在野生Bt菌株中的丰度和分布，前者远远低于后者[2526]。由此推测：在自然界中，cry1Ca基因可能比cry1Ac基因更加保守，而且在自然界中分布有限。本文研究结果也印证了这一点：472个菌株仅有22个菌株含有cry1Ca基因，而且5种类型的22个菌株中的cry1Ca基因全部为cry1Ca7。因此若要挖掘新型cry1Ca基因仍需付出更大的努力。
Western Blotting结果证明这些菌株中cry1Ca基因都表达了Cry1Ca蛋白，生物活性测定结果显示供试菌株活化蛋白展示了很高的杀虫活性；但是这样的高活性是仅仅来自于Cry1Ca蛋白的单独贡献，还是其他Cry蛋白协同增效，仍然需要进一步深入研究。 参考文献
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（责任编辑：田 喆）
关键词：苏云金芽胞杆菌； cry1Ca基因； 甜菜夜蛾； 致死中浓度
中图分类号： S 476.11
文献标识码： A
甜菜夜蛾[Spodoptera exigua（Hübner）]属鳞翅目夜蛾科，作为一种世界性的多食性害虫，长期为害包括棉花、番茄、大豆等在内的重要经济作物[1]。在中国，甜菜夜蛾的为害程度日趋严重，给农业生产造成巨大损失[2]。由于化学杀虫剂的滥用，已导致害虫抗性上升、环境污染等严重后果。因此，亟待加强Bt等生物农药的研究和利用。
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），是一种能够特异性毒杀害虫的革兰氏阳性细菌，杀虫活性主要由cry基因所编码的杀虫蛋白起作用[3]。由于Bt杀虫蛋白具有对靶标害虫特异性毒杀以及对非靶标生物如小鼠、人等哺乳动物安全、无毒害等特点[45]，已经成为世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂[67]。1988年第一个cry1Ca基因被克隆，1990年Honée首次报道了这个cry1Ca基因表达产物对甜菜夜蛾具有高毒杀作用[8]。迄今为止，全球已有14个cry1Ca基因公布，来自我国的cry1Ca基因数量达到8个（Bt杀虫蛋白国际命名委员会网站—http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）。国内多家单位先后筛选出对甜菜夜蛾高毒力的Bt菌株，如S184[9]、WY190[10]和Hcy系列[11]、CZE99985[12]、G03[13]等菌株。
本实验室在前期筛选对甜菜夜蛾高毒力菌株的基础上[14]，继续加大力度，采用菌株分型结合PCRRFLP技术，选取了已报道对甜菜夜蛾具有高毒力的cry1Ca基因[8，1516]作为切入点，对我们近两年新分离的Bt菌株进行活性筛选与基因鉴定，发掘对甜菜夜蛾具有高效杀虫活性的菌株，发现了一批高毒力菌株，这些菌株的共同特点就是都含有cry1Ca基因。本研究为高效毒杀甜菜夜蛾的Bt菌株的发掘与利用创造了条件。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 研究菌株来源
472株野生Bt菌株为本实验室从国内土壤中分离、筛选并保存。
阳性对照菌株：HD1Ca7（cry1Ca7基因转入HD 73-工程无晶体突变株），以及G03野生Bt菌株，含有cry1Aa、cry1Ac、cry1Ca、cry2Ab基因，是由河北农林科学院植保所分离，对甜菜夜蛾等夜蛾科害虫具有高毒力。
1.1.2 培养基
液体LB培养基：胰蛋白胨 1%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1%，pH调至7.0，121 ℃灭菌20 min。
液体1/2 LB培养基：胰蛋白胨 0.5%，酵母抽提物 0.25%，NaCl 0.5%，调pH至7.0，121 ℃灭菌20 min。
1.1.3 试虫及人工饲料来源
甜菜夜蛾试虫由武汉科诺生物科技股份有限公司提供；甜菜夜蛾试虫人工饲料由中国农业科学院植物保护研究所棉花害虫组提供。
1.1.4 主要生化试剂
引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；核酸聚合酶、限制性内切酶以及标准DNA、蛋白marker购自大连TaKaRa宝生物工程有限公司；胰蛋白酶（1∶250）购自北京索莱宝生物科技有限公司；第一抗体：小鼠来源单抗，购自美国一龙（Envirologix）公司；第二抗体：HRP标记的羊抗鼠单抗，购自美国Sigma公司；显色液：SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate试剂盒购自Thermo Scientific公司。
1.2 试验方法
1.2.1 cry1Ca基因简并引物设计
通过从Bt杀虫蛋白国际命名委员会网站—http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/网址查询获得目前已报道的cry1Ca第4等级基因共有14个，除cry1Ca10、cry1Ca14外的12条基因编码序列能够通过GenBank登录号从NCBI上下载；将12条基因序列进行多序列比对，设计出能够扩增cry1Ca基因全长的简并引物。
设计引物序列，上游引物5′ATGGAGGAAAATAATCAAAATC3′，下游引物5′ATTASTCCTTATGGAGGAATAA3′。
1.2.2 Bt菌株基因组DNA的提取
基因组DNA提取参考张彦蕊等[17]的方法。
1.2.3 Bt菌株cry1Ca基因鉴定 对472个基因组进行分组，以5～7个菌株基因组混合作为一组模板，利用cry1Ca基因简并引物首先进行第一轮PCR扩增，然后对能够扩增出信号的混合基因组再分别进行第二轮筛选，最终确定到菌株。
PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3.5 min，30次循环；72 ℃延伸10 min。
PCR反应体系：2×PCR Taq Mixture 10 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，超纯水7 μL，总计20 μL体系。
1.2.4 cry1Ca基因的扩增、克隆与测序分析
包括Cry1Ca原毒素在内的所有130 ku Cry蛋白都包含一个位于N末端、600氨基酸的活性区域[18] （C末端与杀虫作用无关）。因此从基因的5′端到约2.2 kb设计引物，利用PrimeStar高保真聚合酶扩增，产物连接载体送测序。设计引物序列：上游引物5′ATGGAGGAAAATAATCAAAATC3′，下游引物5′AATTAAAAGCTTATACCCGT3′。
PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35次循环；72 ℃延伸10 min。
PCR反应体系：2×PrimeStar 10 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，超纯水7 μL，总计20 μL体系。
测序交由北京擎科新业生物技术有限公司完成。
1.2.5 菌株晶体形态观察
利用1/2 LB培养基对供试菌株培养30 h，BX 63显微镜（日本Olympus）进行100×油镜观察并拍照，具体方法参见文献[19]。
1.2.6 菌株cry基因多样性分析
采用PCRRFLP技术对筛选出的野生菌株进行cry基因类型的多样性分析；简并引物及PCRRFLP流程参考束长龙建立的方法[20]。该对简并引物是作者根据多类cry基因的保守区同源序列经过聚类分析所设计，利用HinfⅠ限制性内切酶对扩增产物进行酶切，能够展示出不同带型的酶切图谱，有助于对不同Bt菌株的cry基因组成进行差别鉴定。
参考引物序列：上游引物con_1f序列5′TATGCWCAAGCWGCCAATYTWCATYT3′，下游引物con_5r序列5′GGRATAAATTCAATTYKRTCWA3′。
PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，38 ℃退火2 min，72 ℃延伸2 min，30次循环；72 ℃延伸10 min。
PCR反应体系：2×PCR Taq Mixture 15 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，超纯水12 μL，总计30 μL。
PCR酶切体系：PCR产物10 μL，酶切缓冲液3 μL，HinfⅠ 1 μL，超纯水16 μL，37 ℃反应2 h。
1.2.7 Cry蛋白提取、胰蛋白酶消化以及定量
菌株Cry蛋白提取采用1/2 LB液体培养基、重复溶解的方法进行提取，具体详见Zhou等的方法[19]。菌株提取Cry蛋白的SDSPAGE分析参考萨姆布鲁克等[21]的方法进行；并以1.0 μg（浓度为0.2 mg/mL）牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白进行条带定量，定量采用图像分析软件（Image J）测定电泳条带灰度值，并根据标准BSA浓度计算Cry蛋白浓度。参考Bravo文献[22]选择胰蛋白酶（1∶250）对提取的Cry蛋白进行消化：按照质量比1∶10（胰蛋白酶∶Cry蛋白质）加入胰蛋白酶，37 ℃下消化2 h，继而对消化蛋白条带进行SDSPAGE分析、定量。
1.2.8 Western Blotting对筛选菌株cry1Ca基因表达检测
对供试菌株所提取Cry蛋白的消化产物进行10% SDSPAGE电泳：2块凝胶重复，其中1块作为平行胶进行考马斯亮蓝染色，另一块用于Western Blotting分析。利用eBlot快速转印仪（中国Genscript）10 min将胶上蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉（1×TBST溶解）室温封闭2 h；1×TBST漂洗3次，每次10 min；加入TBST稀释的鼠抗Cry1Ca蛋白单克隆抗体（1∶1 000），室温孵育1 h；1×TBST漂洗3次，每次10 min；加入HRP标记的羊抗鼠二抗（1∶2 000），室温孵育1 h；1×TBST漂洗3次，每次10 min；膜上加显色液，利用ImageQuant LAS 4000 mini凝胶成像仪（美国GE Healthcare）进行曝光、拍照。
1.2.9 甜菜夜蛾杀虫活性的测定
甜菜夜蛾杀虫活性的初步测定：处理组样品为所筛选22株野生Bt菌株、对照菌株G03、HD1Ca7菌株提取的Cry蛋白，共计24组；添加一定比例胰蛋白酶的50 mmol/L Na2CO3（pH=10.0）溶液设立为阴性对照组。按照10 g/重复称取人工饲料分别置于规格为60 mm的培养皿中，分别加入1 mL待测样品溶液，并将其充分混合均匀。每处理组设初始浓度70 μg/g、1/10初始浓度7 μg/g，每个浓度2个重复，每重复接初孵试虫30头。完成分装并放置于26 ℃光照培养箱（光周期L∥D=12 h∥12 h）进行为期7 d的培养。每天检查培养箱内温度、相对湿度及饲料是否变质；到期分别调查试虫死、活虫数目，统计并计算校正死亡率[23]。校正死亡率计算公式如下：
校正死亡率（%）=[（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）]×100%。
菌株LC50 值测定：选择对照菌株G03、HD1Ca7菌株以及经PCRRFLP分析、cry基因组成有差异的菌株进行复筛；LC50梯度设立6.000、2.000、0.667、0.222、0.074、0.025 μg/g共6个浓度，每个浓度3个重复，每重复接30头初孵试虫，其他流程同初筛。参考Vincent[24]的方法，利用SPSS 13.0软件进行LC50值的计算。 2 结果与分析
2.1 含有cry1Ca基因菌株鉴定与测序分析
利用所设计引物对472个提取的野生Bt菌株基因组进行PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳，最终筛选发现22株野生Bt菌株能够扩增出大小为3 570 bp的明显条带（图1）。测序结果同已知的cry1Ca基因进行比对，结果发现22条基因5′端到约2.2 kb序列同cry1Ca7基因的活性区域序列完全相同。
2.2 菌株晶体形态观察
对22株Bt菌株进行光学显微镜晶体形态观察，发现这22株菌株晶体均呈现出与参照菌株G03一致的双锥体形（图2）。
2.3 利用PCRRFLP对筛选菌株进行cry基因多样性鉴定
利用该对简并引物对22株野生菌株进行PCR扩增，结果显示从这些菌株基因组中均能够扩增出一条大小约为1.4 kb的明显条带（图3a）；继而对扩增的1.4 kb条带进行HinfⅠ限制性内切酶酶切，经2%琼脂糖凝胶电泳，结果展示出不同酶切图谱（图3b）。对酶切图谱条带数目以及大小进行分析，确定这22个样品酶切带型汇总为5类（图3c），其中类型1对应菌株为B16C8；类型2对应菌株为C12C8、T1A2、T1A5、T1D7、T1F10、T3C12、T3E10、T4C10、T5E8共9株；类型3对应菌株为T1B8；类型4为T1E12、T1F1、T2C8、T2D2、T2C12、T2D10、T3A8共7株；类型5为B15B4、T1E10、T1E9、T2C5共4株。G03菌株PCRRFLP结果（图3d），其酶切图谱与类型2相似。
2.4 Cry蛋白提取、消化、定量
对供试菌株提取的Cry蛋白进行SDSPAGE分析，结果显示菌株均表达分子量大小约为130 ku的蛋白（图4）。按照条带扫描情况计算出了Cry蛋白浓度；利用胰蛋白酶按照比例消化原毒素，图5是2 h消化结果，130 ku消失，蛋白条带集中于60 ku附近，并完成了消化条带的定量计算。
2.5 Western Blotting分析结果
利用Cry1Ca抗体对Cry蛋白消化产物进行Western Blotting分析，结果显示，样品在60 ku均获得较好杂交条带（图6 b），与Cry1Ca阳性对照一致。
2.6 甜菜夜蛾杀虫活性的测定结果
经定量计算的Cry蛋白消化产物，取终浓度为70、7 μg/g分别对甜菜夜蛾进行初步生测，结果说明供试菌株对甜菜夜蛾均有较高毒力（表1）；在70 μg/g浓度下，22株菌株校正死亡率在96%以上（19株菌同对照菌株G03、HD1Ca7，校正死亡率为100%），且存活虫体大小同初孵，无明显增长；7 μg/g浓度下，有18株菌校正死亡率在90%以上，3株菌校正死亡率在84%～90%之间，1株为75.4%。
根据初步生测活性结果并结合基因鉴定酶切图谱差异分析，从5个类型Bt菌株中各选取1株毒力高的为代表（B16C8、C12C8、T1B8、T1E12、T1E10）进行LC50测定；生测结果表明（表2），T1E12（0.087 μg/g）、B16C8（0.103 μg/g）、T1B8（0.202 μg/g）的活性很高，与阳性对照菌株G03（0.090 μg/g）相当；而菌株C12C8（0.610 μg/g）、T1E10（0.677 μg/g）的LC50接近，毒力分别比对照菌株G03低6.8倍和7.5倍。
3 讨论
70多年来，Bt菌株作为微生物杀虫剂已经取得了巨大的成功[6]。虽然Bt在生物农药中所占比例最高，但整个生物农药在农药中所占比重还非常小，因此针对甜菜夜蛾等重要害虫新型高效Bt菌株的挖掘仍然有很大的发展空间。
本研究以对甜菜夜蛾高毒力的cry1Ca基因鉴定入手，从472株野生Bt菌株中成功筛选到22株包含cry1Ca基因的野生Bt菌株，并通过Western Blotting分析证实了这些cry1Ca基因的表达。利用本实验室近期建立的、基于PCRRFLP技术进行菌株分型[20]，将这些菌株分为5种类型。在此基础上，筛选到T1E12、B16C8和T1B8三个菌株，它们对甜菜夜蛾幼虫的活性与阳性对照G03菌株相当。G03菌株是由河北农林科学院植物保护研究所在执行“八五”攻关项目期间分离获得的，对甜菜夜蛾、棉铃虫等夜蛾科以及小菜蛾、亚洲玉米螟等害虫具有高毒力。目前，该菌株已经作为受体菌构建了对鳞翅目、鞘翅目害虫的工程菌株，并于2014年12月获得农业部颁发的转基因生物生产应用证书[13]，正在进行农药登记。这3个高毒力菌株的获得，将丰富我国杀虫菌株资源，为新型Bt生物农药产业化奠定了基础。
cry1Ca第四等级基因自1988年到2015年共报道14个（其中由中国提交的基因有8个，占57.1%）；而cry1Ac第四等级基因从1985年到2015年，共报道发现38个（其中由中国提交的基因有16个，占42.1%）（Bt杀虫蛋白国际命名委员会网站http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/），cry1Ca基因的总数远低于cry1Ac基因。从基因鉴定的层面发现，在野生Bt菌株中的丰度和分布，前者远远低于后者[2526]。由此推测：在自然界中，cry1Ca基因可能比cry1Ac基因更加保守，而且在自然界中分布有限。本文研究结果也印证了这一点：472个菌株仅有22个菌株含有cry1Ca基因，而且5种类型的22个菌株中的cry1Ca基因全部为cry1Ca7。因此若要挖掘新型cry1Ca基因仍需付出更大的努力。
Western Blotting结果证明这些菌株中cry1Ca基因都表达了Cry1Ca蛋白，生物活性测定结果显示供试菌株活化蛋白展示了很高的杀虫活性；但是这样的高活性是仅仅来自于Cry1Ca蛋白的单独贡献，还是其他Cry蛋白协同增效，仍然需要进一步深入研究。 参考文献
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（责任编辑：田 喆）