【摘 要】
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构建重组人淋巴毒素(rhLT)随机点突变组合文库以进行体外分子进化及结构和功能的研究.应用含随机核苷酸序列的引物,通过Overlap PCR的方法分别对rhLT 的46、106和130位氨基酸
【机 构】
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第二军医大学基础医学部微生物学教研室,上海,200433上海复旦张江生物医药股份有限公司,上海,201203;第二军医大学基础医学部微生物学教研室,上海,200433;安徽医科大学病理生理学教研室,合
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构建重组人淋巴毒素(rhLT)随机点突变组合文库以进行体外分子进化及结构和功能的研究.应用含随机核苷酸序列的引物,通过Overlap PCR的方法分别对rhLT 的46、106和130位氨基酸进行定点随机突变,获得各单点随机突变体库.通过基因操作将这三个单点随机突变体库拼接并克隆于pMD-18T载体建立三点组合突变体文库,DNA测序鉴定突变位点的随机性和多样性,原核表达该变异体库,体外测定生物学活性.成功获得rhLT三点随机点突变组合文库,其转化克隆数达到1.5×105,是多样性理论值的4.5倍.50个样品的序列分析显示各个位点的核苷酸和氨基酸序列的突变都呈随机性分布.对原核表达的30个样品进行生物学活性测定,结果70%(21个)的样品无活性、23.3%(7个)的样品活性低于rhLT、6.7%(2个)的样品活性高于rhLT.成功构建了rhLT随机点突变组合文库,该库不仅在一级结构上具有良好的随机性和多样性,而且具有生物学活性的多样性,为应用噬菌体展示等高通量筛选策略对淋巴毒素进行体外分子进化和结构与功能的深入研究打下了基础.
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