【摘 要】
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为了提高胆盐水解酶在大肠杆菌中的表达量,研究重组胆盐水解酶的酶学性质。利用大肠杆菌表达系统,对双歧杆菌来源的胆盐水解酶进行了表达。将PCR获得的胆盐水解酶基因克隆至
【机 构】
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食品安全与营养协同创新中心; 江南大学工业生物技术教育部重点实验室; 江南大学生物工程学院; 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江南大学; 江南大学糖化学与生物技
【基金项目】
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国家863计划项目(2011AA100905);国家自然科学基金项目(31100064);教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT1135);中央高校基本科研业务费专项(JUDCF10045);江苏省自然科学基金项目(BK2012553)
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为了提高胆盐水解酶在大肠杆菌中的表达量,研究重组胆盐水解酶的酶学性质。利用大肠杆菌表达系统,对双歧杆菌来源的胆盐水解酶进行了表达。将PCR获得的胆盐水解酶基因克隆至表达载体p ET-22b(+),得到重组质粒p ET-22b(+)-bsh,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经发酵优化,重组菌在20℃、IPTG 1 mmol/L条件下诱导32 h可达最高酶活,对甘氨脱氧胆酸钠和牛磺酸脱氧胆酸钠的酶活分别为135.2 U/m L和121.3 U/m L。采用镍亲和层析柱对重组胆盐水解酶进行纯化,经SDS-PAGE分析,胆盐水解酶相对分子质量(Mr)为35.0×103。酶学性质研究表明,重组胆盐水解酶偏好水解甘氨结合胆盐,对甘氨胆酸钠的催化活性最高,达到220.1 U/mg。酶催化反应的动力学参数经Hill方程拟合,希尔系数大于1,表明底物与酶之间存在协同作用,且不同底物与重组胆盐水解酶之间存在不同的协同作用,表明重组胆盐水解酶属于变构酶。研究结果为其他来源胆盐水解酶在基因工程菌中的表达,和进一步研究胆盐水解酶的结构和催化反应机理提供了参考。
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