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摘要：采用一锅式仿生矿化法形成转化酶@ZIF-8，并通过羧甲基纤维素改性，改变ZIF-8的分散性。用血糖仪检测转化酶水解蔗糖产生的葡萄糖浓度，从而实现了对癌细胞的诊断。在形成ZIF-8的过程中，转化酶的加入大大缩短了ZIF-8的形成时间，而且转化酶与Zn2+之间有静电作用，加速了生物矿化过程。通过对羧甲基纤维素（CMC）的修饰，羧甲基纤维素与ZIF-8之间存在静电作用，改变了英威腾酶@ZIF-8的分散性。重要的是，这是第一次CMC改变了ZIF-8在生物仿生矿化过程中的稳定性和分散性，并被用于便携式血糖仪对癌细胞的早期诊断。基于这些发现，我们证明这种方法适用于检测不同数量的癌细胞，表明我们制备的Invertase@ZIF-8@CMC可以用于便携式血糖仪的癌症早期诊断。
1.前言
最近，MOFs封装的蛋白质的仿生矿化引起了人们的极大兴趣。由于其仿生矿化的封装结构，它们可以增强蛋白质的活性，提高其在各种变性条件下的稳定性。同时，生物样本和实际血液样本可以被长期保存。保证了实际生物样本、血样的运输，并保持其生物活性，解决了生物活性和运输的问题，具有良好的研究意义。然后，仿生矿化MOFs封装的蛋白质在稳定性和分散性方面仍然存在挑战。MOFs已经被应用于各种有价值的材料，包括气体储存、催化和吸附分离。本文选择了低细胞毒性和可生物降解的MOFs。沸石咪唑骨架-8（ZIF-8），由Zn2+和2-甲基咪唑（2-HmIm）之间的配合形成。通过精细控制2-HmIm与Zn2+的浓度比，我们引入了一种简单的一锅式仿生矿化方法来合成纳米级MOFs，以封装高负荷蛋白质。
2.实验
2.1材料
六水硝酸锌（Zn（NO3）2-6H2O）购自成都科隆化学试剂厂。羧甲基纤维素（CMC）购自Macklin，N， N-二甲基甲酰胺（DMF）、氯仿（CHCl3）、乙醇（C2H5OH）、冰醋酸（CH3COOH）购自利安隆博华（天津）药物化学有限公司。蔗糖、Na2HPO4、麦芽糖和CH3COONa购自天津广福精细化工研究所。D-葡萄糖、D-果糖购自上海三友试剂厂。过氧化氢（H2O2，30%）购自四川西桥化工股份有限公司。
2.2实验过程
将5 mL 40 mM （0.5268 g） Zn（NO3）2-6H2O和5 mL 160 mM （1.576 g） 2-HmIm加入到20 mL玻璃瓶中，并将混合物放置24小时。最后，对混合物进行离心洗涤，并进行干燥，得到ZIF-8的白色粉末。称取60.9毫克的羧甲基纤维素钠，加入到30毫升的蒸馏水中并充分搅拌。加入两滴浓盐酸，将混合物磁力搅拌并保持24小时。最后，将反应混合物对着透析袋透析三天，直到溶液的pH值为中性，收集溶液并储存起来以备后。将80毫克的Invertase加入到5毫升的40mM（0.5268克）Zn（NO3）2-6H2O中并充分搅拌后，将5毫升的160mM（1.576克）的2-HmIm加入到上述混合物中，然后将混合物放置5分钟。最后，将得到的混合物离心洗涤，并干燥，得到Invertase@ZIF-8白色粉末。称出20毫克Invertase@ZIF-8白色粉末，加入10毫升10%的CMC-COOH溶液中，在室温下磁力搅拌24小时。最终得到Invertase@ZIF-8@CMC溶液。取10mL制备好的Invertase@ZIF-8@CMC溶液，然后加入100uL活化的FA-NH2溶液，将混合物在室温下暗中搅拌24小时。最后得到Invertase@ZIF-8@CMC@FA溶液，并在黑暗中保存以备将来实验使用。
3结果和讨论
3.1材料的合成和表征
用SEM和TEM来表征ZIF-8、Invertase@ZIF-8、Invertase@ZIF-8@CMC的形貌。如图1所示，分别是ZIF-8、Invertase@ZIF-8、Invertase@ZIF-8@CMC的SEM和TEM图像。从图1a，1d可以看出，Zn2+和2-甲基咪唑（2-HmIm）之间的配位形成的ZIF-8是一个十二面体的形状。从图1b、1e可以看出，通过仿生矿化过程形成的Invertase@ZIF-8可以保持ZIF-8的形态，而加入蔗糖酶可以明显缩短ZIF-8的形成时间。从图1c和1f可以看出，羧甲基纤维素（CMC）被涂在ZIF-8的表面。
3.2如图2a所示，ZIF-8和模拟ZIF-8的XRD特征衍射峰图谱完全一致。ZIF-8的XRD特征衍射峰（011）、（002）、（112）、（022）、（013）、（222）、（114）、（233）、（134）、（144）。同样，Invertase@ZIF-8和模拟ZIF-8的XRD特征衍射峰谱也完全一致。解释Invertase@ZIF-8生物仿生矿化过程的完成。从FT-IR（图2b）可以看出，Invertase@ZIF-8，1640cm-1代表Zn和蔗糖酶C=0的存在，進一步说明ZIF-8中Invertase的存在。在Invertase@ZIF-8@CMC中，我们可以看到1600 cm-1和2445 cm-1的强吸收带，表明纤维素（CMC）中存在-COO-功能团。在Invertase@ZIF-8@CMC@FA的红外图像中，1670 cm-1对应于叶酸（FA）中存在的-NH2-功能团。如图2c所示，Invertase@ZIF-8@CMC的热重分析经历了几个阶段的重量损失。在25-270℃的温度范围内，Invertase的第一次损失是由于吸附的水的分解。在270-340℃的温度范围内的第二次失重对应于英威腾酶的分解，在340℃后失重基本保持不变，表明英威腾酶的分解几乎已经完成。ZIF-8在25-160℃温度范围内的第一次损失是由于吸附的水的分解。在160-233℃的温度范围内的第二次失重与结合水的分解有关。在233-800℃的温度范围内发生的第三次失重与ZIF-8的分解有关，同时结构塌陷。从图2c可以看出，Invertase@ZIF-8和ZIF-8的热分解趋势和分解温度是一样的，Invertase@ZIF-8的分解趋势更加明显。通过比较ZIF-8和Invertase@ZIF-8在270-340℃时的最大分解，在这个温度下正好对应于Invertase的分解，我们可以发现Invertase的负载为10wt%。 如图3a所示，ZIF-8的比表面积（BET）为1376.4m2/g，而Invertase@ZIF-8的比表面积（BET）为989.2m2/g。我们发现，加入Invertase后，比表面积比原来的ZIF-8减少了387.2 m2/g，Invertase进入ZIF-8并占据其孔隙，导致BET的下降。如图3b所示，从紫外-可见光谱可以看出，ZIF-8、Invertase@ZIF-8、Invertase@ZIF-8@CMC都没有明显的紫外吸收峰，但在Invertase@ZIF-8@CMC@FA中，在279nm和345nm处有明显的吸收。在345纳米处有一个明显的叶酸紫外吸收峰，进一步表明材料中存在叶酸（FA）。我们之前已经证明了叶酸在红外线中存在一个-NH2-功能团。
3.3敏感地检测癌细胞，用于癌症的早期诊断
在应用前评估了Invertase@ZIF-8@CMC的细胞毒性活性，并用于癌细胞检测。用Invertase@ZIF-8@CMC培养细胞活力，HeLa细胞的Invertase@ZIF-8@CMC在48小时内保持在30微克/毫升，表明Invertase@ZIF-8@CMC@FA的细胞毒性低。为了证明该探针的潜在临床用途，该传感器还被用于检测全血中的HeLa细胞。如图5a所示，血糖仪读数的变化随着Invertase@ZIF-8@CMC浓度的变化而变化。我们测试了HeLa细胞（过量表达叶酸受体）和叶酸受体表达不足的NIH3T3细胞来表征Invertase@ZIF-8@CMC的性能。将Invertase@ZIF-8@CMC@FA培養一小时。然后用PBS缓冲液清洗细胞，以去除不粘附在细胞表面的物质，并加入蔗糖溶液进行反应。如图5b所示，相同数量的HeLa和NIH3T3细胞的血糖仪读数的变化。这一结果清楚地表明，通过葡萄糖浓度的变化可以很容易地识别出FA阳性的癌细胞和正常细胞之间的差异。如图6c所示，用Invertase@ZIF-8@CMC培养不同数量的HeLa细胞。随着细胞数量的增加，血糖仪所测得的PGM读数不断增加，并显示出良好的线性相关性。因此，这种血糖仪检测葡萄糖浓度变化的检测平台对于高灵敏度和快速的早期癌症诊断是非常理想的，在临床和护理点有潜在的应用，在生物医学和癌症诊断方面有重要的应用前景。
4.结论
综上所述，制备的分散性Invertase@ZIF-8@CMC被应用于便携式血糖仪的癌症早期诊断。Invertase@ZIF-8是通过一锅式仿生物矿化法形成的。生物相容性的羧甲基纤维素（CMC）涂层改变了ZIF-8的分散性，提供了良好的稳定性和分散性。形成的Invertase@ZIF-8还显示出优良的蛋白质活性和保护蛋白质免受酶介导的降解。此外，Invertase@ZIF-8@CMC@FA首先与癌细胞上的叶酸受体发生作用。我们使用便携式血糖仪检测蔗糖水解产生葡萄糖的酶促作用。我们提供了一种合成分散性Invertase@ZIF-8@CMC材料的新方法，其合成路线简单，成本低，便于携带，灵敏度高，并能识别不同的癌细胞，用于癌症早期临床症状的诊断。因此，它可以作为生物医学研究和临床领域的候选材料。
* 通信作者：汪宝堆（1968-）， 男，汉，甘肃定西人，教授，博士 ，Email：wangjr_123@163.com，研究方向为生物。
1.前言
最近，MOFs封装的蛋白质的仿生矿化引起了人们的极大兴趣。由于其仿生矿化的封装结构，它们可以增强蛋白质的活性，提高其在各种变性条件下的稳定性。同时，生物样本和实际血液样本可以被长期保存。保证了实际生物样本、血样的运输，并保持其生物活性，解决了生物活性和运输的问题，具有良好的研究意义。然后，仿生矿化MOFs封装的蛋白质在稳定性和分散性方面仍然存在挑战。MOFs已经被应用于各种有价值的材料，包括气体储存、催化和吸附分离。本文选择了低细胞毒性和可生物降解的MOFs。沸石咪唑骨架-8（ZIF-8），由Zn2+和2-甲基咪唑（2-HmIm）之间的配合形成。通过精细控制2-HmIm与Zn2+的浓度比，我们引入了一种简单的一锅式仿生矿化方法来合成纳米级MOFs，以封装高负荷蛋白质。
2.实验
2.1材料
六水硝酸锌（Zn（NO3）2-6H2O）购自成都科隆化学试剂厂。羧甲基纤维素（CMC）购自Macklin，N， N-二甲基甲酰胺（DMF）、氯仿（CHCl3）、乙醇（C2H5OH）、冰醋酸（CH3COOH）购自利安隆博华（天津）药物化学有限公司。蔗糖、Na2HPO4、麦芽糖和CH3COONa购自天津广福精细化工研究所。D-葡萄糖、D-果糖购自上海三友试剂厂。过氧化氢（H2O2，30%）购自四川西桥化工股份有限公司。
2.2实验过程
将5 mL 40 mM （0.5268 g） Zn（NO3）2-6H2O和5 mL 160 mM （1.576 g） 2-HmIm加入到20 mL玻璃瓶中，并将混合物放置24小时。最后，对混合物进行离心洗涤，并进行干燥，得到ZIF-8的白色粉末。称取60.9毫克的羧甲基纤维素钠，加入到30毫升的蒸馏水中并充分搅拌。加入两滴浓盐酸，将混合物磁力搅拌并保持24小时。最后，将反应混合物对着透析袋透析三天，直到溶液的pH值为中性，收集溶液并储存起来以备后。将80毫克的Invertase加入到5毫升的40mM（0.5268克）Zn（NO3）2-6H2O中并充分搅拌后，将5毫升的160mM（1.576克）的2-HmIm加入到上述混合物中，然后将混合物放置5分钟。最后，将得到的混合物离心洗涤，并干燥，得到Invertase@ZIF-8白色粉末。称出20毫克Invertase@ZIF-8白色粉末，加入10毫升10%的CMC-COOH溶液中，在室温下磁力搅拌24小时。最终得到Invertase@ZIF-8@CMC溶液。取10mL制备好的Invertase@ZIF-8@CMC溶液，然后加入100uL活化的FA-NH2溶液，将混合物在室温下暗中搅拌24小时。最后得到Invertase@ZIF-8@CMC@FA溶液，并在黑暗中保存以备将来实验使用。
3结果和讨论
3.1材料的合成和表征
用SEM和TEM来表征ZIF-8、Invertase@ZIF-8、Invertase@ZIF-8@CMC的形貌。如图1所示，分别是ZIF-8、Invertase@ZIF-8、Invertase@ZIF-8@CMC的SEM和TEM图像。从图1a，1d可以看出，Zn2+和2-甲基咪唑（2-HmIm）之间的配位形成的ZIF-8是一个十二面体的形状。从图1b、1e可以看出，通过仿生矿化过程形成的Invertase@ZIF-8可以保持ZIF-8的形态，而加入蔗糖酶可以明显缩短ZIF-8的形成时间。从图1c和1f可以看出，羧甲基纤维素（CMC）被涂在ZIF-8的表面。
3.2如图2a所示，ZIF-8和模拟ZIF-8的XRD特征衍射峰图谱完全一致。ZIF-8的XRD特征衍射峰（011）、（002）、（112）、（022）、（013）、（222）、（114）、（233）、（134）、（144）。同样，Invertase@ZIF-8和模拟ZIF-8的XRD特征衍射峰谱也完全一致。解释Invertase@ZIF-8生物仿生矿化过程的完成。从FT-IR（图2b）可以看出，Invertase@ZIF-8，1640cm-1代表Zn和蔗糖酶C=0的存在，進一步说明ZIF-8中Invertase的存在。在Invertase@ZIF-8@CMC中，我们可以看到1600 cm-1和2445 cm-1的强吸收带，表明纤维素（CMC）中存在-COO-功能团。在Invertase@ZIF-8@CMC@FA的红外图像中，1670 cm-1对应于叶酸（FA）中存在的-NH2-功能团。如图2c所示，Invertase@ZIF-8@CMC的热重分析经历了几个阶段的重量损失。在25-270℃的温度范围内，Invertase的第一次损失是由于吸附的水的分解。在270-340℃的温度范围内的第二次失重对应于英威腾酶的分解，在340℃后失重基本保持不变，表明英威腾酶的分解几乎已经完成。ZIF-8在25-160℃温度范围内的第一次损失是由于吸附的水的分解。在160-233℃的温度范围内的第二次失重与结合水的分解有关。在233-800℃的温度范围内发生的第三次失重与ZIF-8的分解有关，同时结构塌陷。从图2c可以看出，Invertase@ZIF-8和ZIF-8的热分解趋势和分解温度是一样的，Invertase@ZIF-8的分解趋势更加明显。通过比较ZIF-8和Invertase@ZIF-8在270-340℃时的最大分解，在这个温度下正好对应于Invertase的分解，我们可以发现Invertase的负载为10wt%。 如图3a所示，ZIF-8的比表面积（BET）为1376.4m2/g，而Invertase@ZIF-8的比表面积（BET）为989.2m2/g。我们发现，加入Invertase后，比表面积比原来的ZIF-8减少了387.2 m2/g，Invertase进入ZIF-8并占据其孔隙，导致BET的下降。如图3b所示，从紫外-可见光谱可以看出，ZIF-8、Invertase@ZIF-8、Invertase@ZIF-8@CMC都没有明显的紫外吸收峰，但在Invertase@ZIF-8@CMC@FA中，在279nm和345nm处有明显的吸收。在345纳米处有一个明显的叶酸紫外吸收峰，进一步表明材料中存在叶酸（FA）。我们之前已经证明了叶酸在红外线中存在一个-NH2-功能团。
3.3敏感地检测癌细胞，用于癌症的早期诊断
在应用前评估了Invertase@ZIF-8@CMC的细胞毒性活性，并用于癌细胞检测。用Invertase@ZIF-8@CMC培养细胞活力，HeLa细胞的Invertase@ZIF-8@CMC在48小时内保持在30微克/毫升，表明Invertase@ZIF-8@CMC@FA的细胞毒性低。为了证明该探针的潜在临床用途，该传感器还被用于检测全血中的HeLa细胞。如图5a所示，血糖仪读数的变化随着Invertase@ZIF-8@CMC浓度的变化而变化。我们测试了HeLa细胞（过量表达叶酸受体）和叶酸受体表达不足的NIH3T3细胞来表征Invertase@ZIF-8@CMC的性能。将Invertase@ZIF-8@CMC@FA培養一小时。然后用PBS缓冲液清洗细胞，以去除不粘附在细胞表面的物质，并加入蔗糖溶液进行反应。如图5b所示，相同数量的HeLa和NIH3T3细胞的血糖仪读数的变化。这一结果清楚地表明，通过葡萄糖浓度的变化可以很容易地识别出FA阳性的癌细胞和正常细胞之间的差异。如图6c所示，用Invertase@ZIF-8@CMC培养不同数量的HeLa细胞。随着细胞数量的增加，血糖仪所测得的PGM读数不断增加，并显示出良好的线性相关性。因此，这种血糖仪检测葡萄糖浓度变化的检测平台对于高灵敏度和快速的早期癌症诊断是非常理想的，在临床和护理点有潜在的应用，在生物医学和癌症诊断方面有重要的应用前景。
4.结论
综上所述，制备的分散性Invertase@ZIF-8@CMC被应用于便携式血糖仪的癌症早期诊断。Invertase@ZIF-8是通过一锅式仿生物矿化法形成的。生物相容性的羧甲基纤维素（CMC）涂层改变了ZIF-8的分散性，提供了良好的稳定性和分散性。形成的Invertase@ZIF-8还显示出优良的蛋白质活性和保护蛋白质免受酶介导的降解。此外，Invertase@ZIF-8@CMC@FA首先与癌细胞上的叶酸受体发生作用。我们使用便携式血糖仪检测蔗糖水解产生葡萄糖的酶促作用。我们提供了一种合成分散性Invertase@ZIF-8@CMC材料的新方法，其合成路线简单，成本低，便于携带，灵敏度高，并能识别不同的癌细胞，用于癌症早期临床症状的诊断。因此，它可以作为生物医学研究和临床领域的候选材料。
* 通信作者：汪宝堆（1968-）， 男，汉，甘肃定西人，教授，博士 ，Email：wangjr_123@163.com，研究方向为生物。