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摘要 采用半静态水鱼类毒性测试法，分别研究了3种典型甲氧基丙烯酸酯类农药对斑马鱼的急性毒性效应。结果表明：95%吡唑醚菌酯原药、93%嘧菌酯原药、97%啶氧菌酯原药对斑马鱼急性毒性的LC50（96 h）值分别为6.35×10-2、0.393、0.212 mg a.i./L；根据《化学农药环境安全评价试验准则》（GB/T 31270.12—2014）中提出的农药毒性划分标准，95%吡唑醚菌酯原药、93%嘧菌酯原药、97%啶氧菌酯原药对斑马鱼的毒性等级依次为剧毒、高毒、高毒。
关键词 甲氧基丙烯酸酯类农药；斑马鱼；急性毒性
中图分类号 X171.5 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）15-0125-02
Acute Toxicity of Three Strobilurin Fungicide on Brachydonio rerio
LIU Xiao-bo ZHU Hong-jian *
（College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128）
Abstract Acute toxicity study was conducted to evaluate the risk of three strobilurin fungicide on Brachydonio rerio by semi-static test. Results of acute toxicity test showed that LC50（96 h）values of 95% pyraclostrobin technical，93% azoxystrobin technical，97% picoxystrobin technical were 6.35×10-2、0.393、0.212 mg a.i./L，respectively. According to the pesticide virulence classification standard suggested by Chemical Pesticide Environmental Safety Evaluation Test Guidelines（GB/T 31270.12—2014），virulence of 95% pyraclostrobin technical，93% azoxystrobin technical，97% picoxystrobin technical on Brachydonio rerio were highly toxic，high toxic，high toxic，respectively.
Key words strobilurin fungicide；Brachydonio rerio；acute toxicity
甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是农用杀菌剂中的主流产品之一，21世纪初得到迅猛发展，至2010年全世界甲氧基丙烯酸酯类产品的销售总额达到27.62亿美元，占世界杀菌剂市场总销售额的25%[1]，其销量已超过三唑类，成为销售量最大的一类杀菌剂[2]。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是基于天然抗生素Strobilurin A为先导化合物开发的新型杀菌剂，几乎对所有真菌类病害均具有良好的生物活性，对14-脱甲基化酶抑制剂、二羧酰胺类、苯并咪唑类和苯甲酰胺类产生抗性的菌株具有较好的效果[3]。其作用机理是通过抑制病原菌细胞线粒体中色素b和c1之间的电子传递，从而抑制线粒体呼吸作用，最终导致病原菌细胞死亡[4]。目前，广泛使用的品种有嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、醚菌酯、啶氧菌酯等。
农药使用过程中70%～80%的农药未达到防治靶标的作用，而是直接分散到环境中[5]，环境中的农药通过地表径流、漂移等途径进入水生生态系统，对水生生物具有较大的环境风险。目前，大部分研究集中在甲氧基丙烯酸酯类农药对人类和哺乳动物的影响，已知其对陆生动物的的毒性较低[6]，对鱼类的生态风险高，但相关研究报道甚少。因此，综合评价甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类安全性对于规避农药使用的环境风险具有重要意义。
本研究以生态毒理学中的模式生物斑马鱼[7-8]为研究对象，开展吡唑醚菌酯、嘧菌酯、啶氧菌酯对斑马鱼的急性毒性试验研究，旨在确定3种广泛使用的典型甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类的急性毒性效应，同时对甲氧基丙烯酸酯类农药的环境安全性进行初步评估。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试农药。供试农药包括95%吡唑醚菌酯原药、93%嘧菌酯原药、97%啶氧菌酯原药，均由湖南农业大学农药研究所提供。
1.1.2 受试生物。试验用斑马鱼（Brachydonio rerio）为野生型AB品系，购自中国科学院水生生物研究所，体长2.5～3.5 cm，体重0.2～0.3 g，在试验所需环境条件下驯养7 d，驯养期间每天喂食2次市售饵料，斑马鱼生长正常，无死亡，试验前24 h停止喂食。
1.1.3 试验用水。试验用水为曝气48 h的自来水，试验采用自然光照，水温21～25 ℃，溶解氧含量为7～9 mg/L，pH值为7.5～8.5，水质硬度为46～49 mg/L（以CaCO3计）。
1.2 试验方法
分别将供试农药用丙酮溶解，并用蒸馏水定容得到母液，然后移取不同体积的母液置于鱼缸内，试验终体积为6 L。根据预试验结果设计试验浓度，95%吡唑醚菌酯原药终浓度为5.00×10-2、5.75×10-2、6.61×10-2、7.60×10-2、8.74×10-2 mg a.i./L，93%嘧菌酯原药终浓度为0.300、0.360、0.432、0.518、0.622 mg a.i./L，97%啶氧菌酯原药终浓度为0.100、0.150、0.225、0.338、0.507 mg a.i./L，以不加药的处理作为空白对照组，加入丙酮的处理为溶剂对照组，每个试验组10尾鱼。 试验采用半静态试验法，药剂处理后24、48、72 h更换试验药液，每天观察并记录试验鱼的中毒症状和死亡数，及时清除死鱼，试验持续观察至药剂处理后96 h。
1.3 数据处理方法
采用Excel分析试验结果，绘制死亡率曲线；并用统计软件SPSS 18.0分别计算95%吡唑醚菌酯原药、93%嘧菌酯原药、97%啶氧菌酯原药对斑马鱼的LC50值和95%置信区间，建立“剂量—效应”线性方程。
参照《化学农药环境安全评价试验准则》[9]（GB/T 31270.12-2014）中提出的标准对农药毒性进行划分：LC50（96 h）>10 mg a.i./L，低毒；1.0 mg/L 2 结果与分析
试验期间，空白对照组和溶剂对照组试验鱼未出现死亡和可见的异常行为。95%吡唑醚菌酯原药处理组斑马鱼出现游动缓慢、鳃部出血、游动失去平衡等中毒症状，各浓度组试验鱼出现不同程度的死亡，并呈现出良好的剂量效应关系，72 h死亡率达到峰值，死亡率趋于稳定。93%嘧菌酯原药处理组斑马鱼出现游动缓慢、游动失去平衡、腹部膨胀等中毒症状。48、72 h死亡率达到峰值，最高浓度处理组试验鱼全部死亡。97%啶氧菌酯原药处理组斑马鱼出现游动缓慢、游动失去平衡、侧卧缸底等中毒症状，97%啶氧菌酯原药浓度与斑马鱼死亡率之间呈现出良好的剂量效应关系，72 h死亡率达到峰值，最高浓度的处理组中试验鱼全部死亡。
通过对不同处理组斑马鱼死亡数的分析，得到各时间段药剂的浓度对数与概率单位的回归方程、LC50值及其95%置信区间（表1），通过观察和数据统计得到，95%吡唑醚菌酯原药、93%嘧菌酯原药、97%啶氧菌酯原药对斑马鱼急性毒性的LC50（96 h）值分别为6.35×10-2、0.393、0.212 mg a.i./L，3种甲氧基丙烯酸酯类农药对斑马鱼的毒性等级依次为剧毒、高毒、高毒。
3 结论与讨论
吡唑醚菌酯、嘧菌酯和啶氧菌酯是销售额较大，使用范围最广泛的3种甲氧基丙烯酸酯类农药，Olsvik等[10]研究发现嘧菌酯可引起大西洋鲑鱼细胞的氧化胁迫，并通过影响大西洋鲑鱼的细胞呼吸作用加速细胞的调亡。张富国等[11]研究表明嘧菌酯原药和制剂对斑马鱼均具有中等以上毒性。李祥英等[12]对嘧菌酯和吡唑醚菌酯的研究表明，嘧菌酯对羊角月芽藻、大型溞和斑马鱼的急性毒性均为高毒，吡唑醚菌酯对羊角月芽藻、大型溞和斑马鱼的急性毒性分别为中毒、剧毒和剧毒。啶氧菌酯对鱼类的毒性鲜有报道，但对鱼类具有较高环境风险。本研究选择3种典型甲氧基丙烯酸酯类农药开展试验研究，结果表明，95%吡唑醚菌酯原药、93%嘧菌酯原药、97%啶氧菌酯原药对斑马鱼急性毒性的LC50（96 h）值分别为6.35×10-2、0.393、0.212 mg a.i./L，毒性等级分别为剧毒、高毒、高毒，这与张富国和李祥英的研究结果相同。
鱼类急性毒性试验是评价水体污染、农药蓄积及其对人类潜在毒性的一种重要手段。鱼类常被作为水质环境的指示生物。Tisler等[13]和陈爱梅等[14]通过开展斑马鱼急性毒性试验，对吡虫啉的环境危害进行了初步评估。本研究的结果显示，3种典型甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类毒性较高，甚至为剧毒水平。甲氧基丙烯酸酯类农药作用机理类似，选择3种典型农药能较好的涵盖此类农药的特性，3种典型农药的试验结果均显示为较高毒性[15-16]，可以推测甲氧基丙烯酸酯类农药的使用对鱼类安全具有较大威胁。
本文的急性毒性研究结果表明，甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类毒性较高，在施用此类农药时应远离水生生态系统，也可通过控制其施用剂量和施用范围减少对水生生态环境的危害。本研究系统评价了甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类的急性毒性，是风险评价的基础研究，甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类繁殖影响及其致毒机理有待进一步深入研究。
4 参考文献
[1] 关爱莹，李慧超，张金波，等.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的发展沿革及几个主要品种的合成[J].精细与专用化学品，2012，20（4）：24-28.
[2] 赵平，严秋旭，李新，等.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的开发及抗性发展现状[J].农药，2011，50（8）：547-551.
[3] 张国生.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的应用、开发现状及展望[J].农药科学与管理，2003，24（12）：30-34.
[4] 思彬彬，杨卓.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂作用机理研究进展[J].世界农药，2007，29（6）：5-9.
[5] 于彩虹，黄莹，胡琳娜，等.农药对水生植物风险评估研究进展[J].安全与环境学报，2013，13（4）：1-5.
[6] TOMLIN C D S.The Pesticide Manual[M].UK：British Crop Protection Council，2000.
[7] OECD.Draft proposal for a new guideline fish two-generation test guideline[Z].Washington：P D MV F，2002.
[8] 吴迪，单正军，韩志华，等.林丹短期暴露对斑马鱼生长发育和繁殖的影响[J].生态与农村环境学报，2011，27（1）：49-53.
[9] 国家环境保护部.化学农药环境安全评价试验准则（报批稿）[S].北京：中国标准出版社，2011.
[10] OLSVIK P A，KROGLUND F，FINSTAD B，et al.Effects of the fungicide azoxystrobin on Atlantic salmon（Salmo solar L.）smolt[J].Ecotoxicology and Environmental Safety，2010，73（8）：1852-1861.
[11] 张国富，李本杰，王金花，等.不同剂型苯醚甲环唑和嘧菌酯及其原药对斑马鱼的急性毒性评价[J].农业环境科学学报，2014，33（11）：2125-2130.
[12] 李祥英，梁慧君，何裕坚，等.5种杀菌剂对3种水生生物的急性毒性与安全性评价[J].广东农业科学，2014（16）：125-128.
[13] TISLER T，JEMEC A，MOZETIC B，et al.Hazard identification of imid-acloprid to aquatic environment[J].Chemosphere，2009，76：907-914.
[14] 陈爱梅，王金花，夏晓明，等.不同剂型吡虫啉对蚯蚓和斑马鱼的急性毒性评价[J].农业环境科学学报，2013，32（9）：1758-1763.
[15] 王丽，王延霞，李宝聚，等.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂研究进展[J].农药科学与管理，2008（9）：30-33.
[16] 秦榕.部分果蔬中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留测定方法研究[J].兰州：甘肃农业大学，2008.
关键词 甲氧基丙烯酸酯类农药；斑马鱼；急性毒性
中图分类号 X171.5 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）15-0125-02
Acute Toxicity of Three Strobilurin Fungicide on Brachydonio rerio
LIU Xiao-bo ZHU Hong-jian *
（College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128）
Abstract Acute toxicity study was conducted to evaluate the risk of three strobilurin fungicide on Brachydonio rerio by semi-static test. Results of acute toxicity test showed that LC50（96 h）values of 95% pyraclostrobin technical，93% azoxystrobin technical，97% picoxystrobin technical were 6.35×10-2、0.393、0.212 mg a.i./L，respectively. According to the pesticide virulence classification standard suggested by Chemical Pesticide Environmental Safety Evaluation Test Guidelines（GB/T 31270.12—2014），virulence of 95% pyraclostrobin technical，93% azoxystrobin technical，97% picoxystrobin technical on Brachydonio rerio were highly toxic，high toxic，high toxic，respectively.
Key words strobilurin fungicide；Brachydonio rerio；acute toxicity
甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是农用杀菌剂中的主流产品之一，21世纪初得到迅猛发展，至2010年全世界甲氧基丙烯酸酯类产品的销售总额达到27.62亿美元，占世界杀菌剂市场总销售额的25%[1]，其销量已超过三唑类，成为销售量最大的一类杀菌剂[2]。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是基于天然抗生素Strobilurin A为先导化合物开发的新型杀菌剂，几乎对所有真菌类病害均具有良好的生物活性，对14-脱甲基化酶抑制剂、二羧酰胺类、苯并咪唑类和苯甲酰胺类产生抗性的菌株具有较好的效果[3]。其作用机理是通过抑制病原菌细胞线粒体中色素b和c1之间的电子传递，从而抑制线粒体呼吸作用，最终导致病原菌细胞死亡[4]。目前，广泛使用的品种有嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、醚菌酯、啶氧菌酯等。
农药使用过程中70%～80%的农药未达到防治靶标的作用，而是直接分散到环境中[5]，环境中的农药通过地表径流、漂移等途径进入水生生态系统，对水生生物具有较大的环境风险。目前，大部分研究集中在甲氧基丙烯酸酯类农药对人类和哺乳动物的影响，已知其对陆生动物的的毒性较低[6]，对鱼类的生态风险高，但相关研究报道甚少。因此，综合评价甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类安全性对于规避农药使用的环境风险具有重要意义。
本研究以生态毒理学中的模式生物斑马鱼[7-8]为研究对象，开展吡唑醚菌酯、嘧菌酯、啶氧菌酯对斑马鱼的急性毒性试验研究，旨在确定3种广泛使用的典型甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类的急性毒性效应，同时对甲氧基丙烯酸酯类农药的环境安全性进行初步评估。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试农药。供试农药包括95%吡唑醚菌酯原药、93%嘧菌酯原药、97%啶氧菌酯原药，均由湖南农业大学农药研究所提供。
1.1.2 受试生物。试验用斑马鱼（Brachydonio rerio）为野生型AB品系，购自中国科学院水生生物研究所，体长2.5～3.5 cm，体重0.2～0.3 g，在试验所需环境条件下驯养7 d，驯养期间每天喂食2次市售饵料，斑马鱼生长正常，无死亡，试验前24 h停止喂食。
1.1.3 试验用水。试验用水为曝气48 h的自来水，试验采用自然光照，水温21～25 ℃，溶解氧含量为7～9 mg/L，pH值为7.5～8.5，水质硬度为46～49 mg/L（以CaCO3计）。
1.2 试验方法
分别将供试农药用丙酮溶解，并用蒸馏水定容得到母液，然后移取不同体积的母液置于鱼缸内，试验终体积为6 L。根据预试验结果设计试验浓度，95%吡唑醚菌酯原药终浓度为5.00×10-2、5.75×10-2、6.61×10-2、7.60×10-2、8.74×10-2 mg a.i./L，93%嘧菌酯原药终浓度为0.300、0.360、0.432、0.518、0.622 mg a.i./L，97%啶氧菌酯原药终浓度为0.100、0.150、0.225、0.338、0.507 mg a.i./L，以不加药的处理作为空白对照组，加入丙酮的处理为溶剂对照组，每个试验组10尾鱼。 试验采用半静态试验法，药剂处理后24、48、72 h更换试验药液，每天观察并记录试验鱼的中毒症状和死亡数，及时清除死鱼，试验持续观察至药剂处理后96 h。
1.3 数据处理方法
采用Excel分析试验结果，绘制死亡率曲线；并用统计软件SPSS 18.0分别计算95%吡唑醚菌酯原药、93%嘧菌酯原药、97%啶氧菌酯原药对斑马鱼的LC50值和95%置信区间，建立“剂量—效应”线性方程。
参照《化学农药环境安全评价试验准则》[9]（GB/T 31270.12-2014）中提出的标准对农药毒性进行划分：LC50（96 h）>10 mg a.i./L，低毒；1.0 mg/L
试验期间，空白对照组和溶剂对照组试验鱼未出现死亡和可见的异常行为。95%吡唑醚菌酯原药处理组斑马鱼出现游动缓慢、鳃部出血、游动失去平衡等中毒症状，各浓度组试验鱼出现不同程度的死亡，并呈现出良好的剂量效应关系，72 h死亡率达到峰值，死亡率趋于稳定。93%嘧菌酯原药处理组斑马鱼出现游动缓慢、游动失去平衡、腹部膨胀等中毒症状。48、72 h死亡率达到峰值，最高浓度处理组试验鱼全部死亡。97%啶氧菌酯原药处理组斑马鱼出现游动缓慢、游动失去平衡、侧卧缸底等中毒症状，97%啶氧菌酯原药浓度与斑马鱼死亡率之间呈现出良好的剂量效应关系，72 h死亡率达到峰值，最高浓度的处理组中试验鱼全部死亡。
通过对不同处理组斑马鱼死亡数的分析，得到各时间段药剂的浓度对数与概率单位的回归方程、LC50值及其95%置信区间（表1），通过观察和数据统计得到，95%吡唑醚菌酯原药、93%嘧菌酯原药、97%啶氧菌酯原药对斑马鱼急性毒性的LC50（96 h）值分别为6.35×10-2、0.393、0.212 mg a.i./L，3种甲氧基丙烯酸酯类农药对斑马鱼的毒性等级依次为剧毒、高毒、高毒。
3 结论与讨论
吡唑醚菌酯、嘧菌酯和啶氧菌酯是销售额较大，使用范围最广泛的3种甲氧基丙烯酸酯类农药，Olsvik等[10]研究发现嘧菌酯可引起大西洋鲑鱼细胞的氧化胁迫，并通过影响大西洋鲑鱼的细胞呼吸作用加速细胞的调亡。张富国等[11]研究表明嘧菌酯原药和制剂对斑马鱼均具有中等以上毒性。李祥英等[12]对嘧菌酯和吡唑醚菌酯的研究表明，嘧菌酯对羊角月芽藻、大型溞和斑马鱼的急性毒性均为高毒，吡唑醚菌酯对羊角月芽藻、大型溞和斑马鱼的急性毒性分别为中毒、剧毒和剧毒。啶氧菌酯对鱼类的毒性鲜有报道，但对鱼类具有较高环境风险。本研究选择3种典型甲氧基丙烯酸酯类农药开展试验研究，结果表明，95%吡唑醚菌酯原药、93%嘧菌酯原药、97%啶氧菌酯原药对斑马鱼急性毒性的LC50（96 h）值分别为6.35×10-2、0.393、0.212 mg a.i./L，毒性等级分别为剧毒、高毒、高毒，这与张富国和李祥英的研究结果相同。
鱼类急性毒性试验是评价水体污染、农药蓄积及其对人类潜在毒性的一种重要手段。鱼类常被作为水质环境的指示生物。Tisler等[13]和陈爱梅等[14]通过开展斑马鱼急性毒性试验，对吡虫啉的环境危害进行了初步评估。本研究的结果显示，3种典型甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类毒性较高，甚至为剧毒水平。甲氧基丙烯酸酯类农药作用机理类似，选择3种典型农药能较好的涵盖此类农药的特性，3种典型农药的试验结果均显示为较高毒性[15-16]，可以推测甲氧基丙烯酸酯类农药的使用对鱼类安全具有较大威胁。
本文的急性毒性研究结果表明，甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类毒性较高，在施用此类农药时应远离水生生态系统，也可通过控制其施用剂量和施用范围减少对水生生态环境的危害。本研究系统评价了甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类的急性毒性，是风险评价的基础研究，甲氧基丙烯酸酯类农药对鱼类繁殖影响及其致毒机理有待进一步深入研究。
4 参考文献
[1] 关爱莹，李慧超，张金波，等.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的发展沿革及几个主要品种的合成[J].精细与专用化学品，2012，20（4）：24-28.
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[4] 思彬彬，杨卓.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂作用机理研究进展[J].世界农药，2007，29（6）：5-9.
[5] 于彩虹，黄莹，胡琳娜，等.农药对水生植物风险评估研究进展[J].安全与环境学报，2013，13（4）：1-5.
[6] TOMLIN C D S.The Pesticide Manual[M].UK：British Crop Protection Council，2000.
[7] OECD.Draft proposal for a new guideline fish two-generation test guideline[Z].Washington：P D MV F，2002.
[8] 吴迪，单正军，韩志华，等.林丹短期暴露对斑马鱼生长发育和繁殖的影响[J].生态与农村环境学报，2011，27（1）：49-53.
[9] 国家环境保护部.化学农药环境安全评价试验准则（报批稿）[S].北京：中国标准出版社，2011.
[10] OLSVIK P A，KROGLUND F，FINSTAD B，et al.Effects of the fungicide azoxystrobin on Atlantic salmon（Salmo solar L.）smolt[J].Ecotoxicology and Environmental Safety，2010，73（8）：1852-1861.
[11] 张国富，李本杰，王金花，等.不同剂型苯醚甲环唑和嘧菌酯及其原药对斑马鱼的急性毒性评价[J].农业环境科学学报，2014，33（11）：2125-2130.
[12] 李祥英，梁慧君，何裕坚，等.5种杀菌剂对3种水生生物的急性毒性与安全性评价[J].广东农业科学，2014（16）：125-128.
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[14] 陈爱梅，王金花，夏晓明，等.不同剂型吡虫啉对蚯蚓和斑马鱼的急性毒性评价[J].农业环境科学学报，2013，32（9）：1758-1763.
[15] 王丽，王延霞，李宝聚，等.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂研究进展[J].农药科学与管理，2008（9）：30-33.
[16] 秦榕.部分果蔬中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留测定方法研究[J].兰州：甘肃农业大学，2008.