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【摘要】目的总结生物测定分子遗传标记技术在中药材鉴定领域的应用。方法查阅、归纳、整理近年来国内外有关中药生物测定的研究文献。结果DNA分子遗传标记技术具有微量、快速、特异性强、准确可靠、对样本要求较低的特点。结论DNA分子鉴定对中药种类与资源等方面的研究起到重要作用。
【关键词】DNA分子遗传标记；PCR；RAPD
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.01.574文章编号：1004-7484（2014）-01-0472-01
中药治疗疾病在中国已有几千年历史，特别是治疗慢性、消耗性疾病具有独特的、西药不可替代的作用。中药品种繁多，同一种中药，由于物种及产地的不同，其质量差异较大，而质量（品质）与中医临床疗效密切相关。因此，为了保证临床用药的安全及质量和疗效的稳定，准确、迅速、简捷的中药鉴定方法的建立已成为当务之急。中药鉴别所依据的遗传标记主要有形态标记、生化标记（包括免疫学标记）、组织细胞标记。这些标记都是基因表达的产物，易受生理状态、生长环境、贮藏加工、生长期、品种等的影响，且标记数目有限，急需新的遗传标记技术。自从Bostein和White等于1980年利用RFLP作为遗传标记，开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。近年来，随着分子生物学技术的进步，DNA分子标记的新技术不断涌现，DNA分子标记技术在中药的应用报道逐渐增多。由于DNA分子标记技术具有快速、微量、特异性强、准确可靠等特点，且不受生育阶段、供试部位、环境条件、贮藏等因素的影响，在中药研究中展示了广阔的应用前景。
1DNA遗传标记的应用范围
1.1鉴定植物种类随着分子生物学技术的发展，DNA分子遗传标记技术已广泛应用于植物品种的整理研究。我国南方部分省区有多种菊科不同属的植物如地胆草、一点红、苦荬菜、毛大子草、山莴苣、苦苣菜以“土公英”混作蒲公英使用。曹晖等[1]利用Ap-PCR和RAPD分子标记技术对蒲公英及六种土公英混淆品进行了DNA指纹鉴别研究，结果显示它们的DNA指纹图谱存在明显差异，利用这种差异可以从分子水平上鉴别蒲公英及其混淆品此外，淫洋藿属八种植物、云南八种木蓝属植物、山冬麦属四种植物等用RAPD技术也得到了准确地鉴定。
1.2鉴定药材道地性道地药材的优良品质是道地药材基因型与特定的环境条件长期作用的结果，特定的基因产生特定的酶，进而调控次生代谢产物等有效成分的产生，因而特定的基因是药材道地性形成的关键。由于道地药材与非道地药材来源于相同或相近的物种种类，在形态、生药性状及化学成分等特征上也常表现出高度的相似性，因而采用传统的方法进行道地药材的鉴别是十分困难的，具有很大的主观性。随着分子生物学技术的快速发展，作为现代分子生物学技术重要手段的RAPD技术的应用，使从分子水平进行道地药材的快速、准确鉴定成为可能。近年来应用RAPD技术进行道地药材的鉴定已取得了一些有价值的研究成果，例如枸杞、姜黄、溪黄草、当归、金银花等药用植物道地性的研究。枸杞主产于宁夏、甘肃、青海、内蒙等地，以宁夏产为最佳道地药材。李军等[2]比较了来自宁夏和内蒙两地的枸杞的RAPD指纹，结果表明，RAPD方法可以很好地鉴定不同来源的枸杞材料。王朝晖[3]等研究了4个来源的穿心莲RAPD图谱。结果各穿心莲RAPD图谱之间可见差异条带，表明不同产地的穿心莲基因确已发生了微小的变异，这种变异可能是导致不同产地穿心莲质量差异的基础之一。
2DNA遗传标记的类别
根据目的基因所在细胞器的不同可分为核DNA标记、线粒体DNA标记和叶绿体DNA标记。线粒体DNA标记主要用于动物的起源进化、亲缘关系、遗传变异、物种鉴别等研究；核DNA和叶绿体DNA分子标记主要存在于高等植物中，尤以核DNA分子标记的应用最多。
DNA分子标记是近年来随着核酸分子技术的发展而研发的，在基因定位、品种鉴定、遗传图谱构建等方面得到了广泛的应用。根据DNA分子标记所采用的核心技术大体上可分为两大类。一是以PCR为基础的DNA分子标记技术，另一类是以分子杂交（southern杂交）为基础的DNA分子标记技术。
基于PCR技术的DNA分子标记鉴别的研究方法依据分析对象可分为两类：其一是采用检测基因组DNA的多态，如随机扩增多态性DNA、AP-PCR、扩增内切酶片断多态性等方法，又称为PCR-DNA指纹法；其二是检测特定片断DNA的多态，即以特定的基因（或短片断的DNA）为研究对象，如PCR产物的限制性片断长度多态性、等位基因特异PCR、DNA直接测序等方法。
3对PCR的影响因素
3.1植物核DNA的提取目前多采用CTAB法。CTAB是一种去污剂。它能跟核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液（0.7mol/lNacl）中可溶并且稳定存在，但如果降低盐的浓度（0.3mol/INacl），CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，但大部分蛋白及多糖仍溶于液中。
3.2模板纯度各浓度等对PCR的影响王培训等[4]以各地产西洋参为研究对象，对影响中药材随机扩增多态性DNA（RAPD）的若干问题进行了探讨。研究发现，中药材DNA模板的降解程度、纯度、浓度，酶的浓度，M92+浓度以及循环参数等诸多因素皆会不同程度的影响扩增结果，同时推荐一个较为适用的循环参数。模板纯度对PCR的影响：分子生物学的各类研究，通常需获得高纯度的DNA，然而在中药飘扬的RAPD研究中，当模板中含有一定量的杂质时，并不影响扩增结果。模板浓度对PCR的影响：对PCR有一定影响，但在一定范围内其扩增结果基本相同。反应介质：BSA能影响PCR扩增结果，不加BSA虽能进行的增，但其条带数少于加少BSA的反应。BSA浓度在0.5-2.0g/l其条带基本一致。此外根据经验，中药材的RAPD扩增Tap酶通常须1.5U/25uL以上方能进行较好扩增，这可能与各厂家Tap酶活性和我们提取的模板中带有某些抑制成分有关。Mg2+、dNTP对扩增结果影响不大，主要是对弱带的影响。
3.3引物的筛选问题商品中药材基因组DNA降解程度差别较大，但合适的引物可得到基本一致的DNA指纹图谱。通常RAPD的产物在200.3000bp形成指纹图，但能使中药材扩增出200.1500bp条带的引物较为合适，因为在此范围内，不同时间样品易出现相同条带即重现性好。
3.4扩增条件在其他参数条件相同时，样品DNA降解相对较为重的模板，在用某些引物扩增时，反应循环数要适应增加，才能得到有效扩增。
3.5污染由于PCR的强大功能与检测的灵敏性，极微量的污染便可导致假阳性结果。故每次PCR反应一定要设立阴性对照孔，检测污染情况。
4小结与展望
中药走向世界，质量保证是一个重要的方面。DNA分子遗传标记技术在中药鉴定及其相关研究方面具有独到的优势和广阔的应用前景，但目前尚处于探索阶段。各种DNA分子遗传技术存在一定的局限性，有待进一步规范和完善。利用DNA分子遗传标记技术，开发有关药用动物遗传背景与化学成分相关性的研究，实现中药品种——质量标准化、基因工程生产天然活性成分寻找和扩大新药源；开发中药重要性状包括品质、产量和抗性的分子标记，实现中药材分子育种及品质人工调控，将是中药分子鉴定学的挑战又是现实意义的大课题。
参考文献
[1]曹晖，毕培曦，邵鹏柱.香港市售蒲公英及其混淆品蒲公英的DNA指纹鉴别研究[J].中国中药杂志，1997，22（4）：197.
[2]李军，郭晏海，秦雪梅.DNA随机扩增多态性分析技术在枸杞道地药材鉴定中的应用[J].中医药研究，2002，18（3）：48-49.
[3]王朝晖，李劲平，王培训.不同产地穿心莲药材的RAPD鉴别初步研究[J].中医药导报，2006，12（5）：4-5，8.
[4]王培训，黄丰，等.商品西洋参DNA指纹图谱鉴别[J].中药新药与临床药理，1999，10（6）：367.
【关键词】DNA分子遗传标记；PCR；RAPD
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.01.574文章编号：1004-7484（2014）-01-0472-01
中药治疗疾病在中国已有几千年历史，特别是治疗慢性、消耗性疾病具有独特的、西药不可替代的作用。中药品种繁多，同一种中药，由于物种及产地的不同，其质量差异较大，而质量（品质）与中医临床疗效密切相关。因此，为了保证临床用药的安全及质量和疗效的稳定，准确、迅速、简捷的中药鉴定方法的建立已成为当务之急。中药鉴别所依据的遗传标记主要有形态标记、生化标记（包括免疫学标记）、组织细胞标记。这些标记都是基因表达的产物，易受生理状态、生长环境、贮藏加工、生长期、品种等的影响，且标记数目有限，急需新的遗传标记技术。自从Bostein和White等于1980年利用RFLP作为遗传标记，开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。近年来，随着分子生物学技术的进步，DNA分子标记的新技术不断涌现，DNA分子标记技术在中药的应用报道逐渐增多。由于DNA分子标记技术具有快速、微量、特异性强、准确可靠等特点，且不受生育阶段、供试部位、环境条件、贮藏等因素的影响，在中药研究中展示了广阔的应用前景。
1DNA遗传标记的应用范围
1.1鉴定植物种类随着分子生物学技术的发展，DNA分子遗传标记技术已广泛应用于植物品种的整理研究。我国南方部分省区有多种菊科不同属的植物如地胆草、一点红、苦荬菜、毛大子草、山莴苣、苦苣菜以“土公英”混作蒲公英使用。曹晖等[1]利用Ap-PCR和RAPD分子标记技术对蒲公英及六种土公英混淆品进行了DNA指纹鉴别研究，结果显示它们的DNA指纹图谱存在明显差异，利用这种差异可以从分子水平上鉴别蒲公英及其混淆品此外，淫洋藿属八种植物、云南八种木蓝属植物、山冬麦属四种植物等用RAPD技术也得到了准确地鉴定。
1.2鉴定药材道地性道地药材的优良品质是道地药材基因型与特定的环境条件长期作用的结果，特定的基因产生特定的酶，进而调控次生代谢产物等有效成分的产生，因而特定的基因是药材道地性形成的关键。由于道地药材与非道地药材来源于相同或相近的物种种类，在形态、生药性状及化学成分等特征上也常表现出高度的相似性，因而采用传统的方法进行道地药材的鉴别是十分困难的，具有很大的主观性。随着分子生物学技术的快速发展，作为现代分子生物学技术重要手段的RAPD技术的应用，使从分子水平进行道地药材的快速、准确鉴定成为可能。近年来应用RAPD技术进行道地药材的鉴定已取得了一些有价值的研究成果，例如枸杞、姜黄、溪黄草、当归、金银花等药用植物道地性的研究。枸杞主产于宁夏、甘肃、青海、内蒙等地，以宁夏产为最佳道地药材。李军等[2]比较了来自宁夏和内蒙两地的枸杞的RAPD指纹，结果表明，RAPD方法可以很好地鉴定不同来源的枸杞材料。王朝晖[3]等研究了4个来源的穿心莲RAPD图谱。结果各穿心莲RAPD图谱之间可见差异条带，表明不同产地的穿心莲基因确已发生了微小的变异，这种变异可能是导致不同产地穿心莲质量差异的基础之一。
2DNA遗传标记的类别
根据目的基因所在细胞器的不同可分为核DNA标记、线粒体DNA标记和叶绿体DNA标记。线粒体DNA标记主要用于动物的起源进化、亲缘关系、遗传变异、物种鉴别等研究；核DNA和叶绿体DNA分子标记主要存在于高等植物中，尤以核DNA分子标记的应用最多。
DNA分子标记是近年来随着核酸分子技术的发展而研发的，在基因定位、品种鉴定、遗传图谱构建等方面得到了广泛的应用。根据DNA分子标记所采用的核心技术大体上可分为两大类。一是以PCR为基础的DNA分子标记技术，另一类是以分子杂交（southern杂交）为基础的DNA分子标记技术。
基于PCR技术的DNA分子标记鉴别的研究方法依据分析对象可分为两类：其一是采用检测基因组DNA的多态，如随机扩增多态性DNA、AP-PCR、扩增内切酶片断多态性等方法，又称为PCR-DNA指纹法；其二是检测特定片断DNA的多态，即以特定的基因（或短片断的DNA）为研究对象，如PCR产物的限制性片断长度多态性、等位基因特异PCR、DNA直接测序等方法。
3对PCR的影响因素
3.1植物核DNA的提取目前多采用CTAB法。CTAB是一种去污剂。它能跟核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液（0.7mol/lNacl）中可溶并且稳定存在，但如果降低盐的浓度（0.3mol/INacl），CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，但大部分蛋白及多糖仍溶于液中。
3.2模板纯度各浓度等对PCR的影响王培训等[4]以各地产西洋参为研究对象，对影响中药材随机扩增多态性DNA（RAPD）的若干问题进行了探讨。研究发现，中药材DNA模板的降解程度、纯度、浓度，酶的浓度，M92+浓度以及循环参数等诸多因素皆会不同程度的影响扩增结果，同时推荐一个较为适用的循环参数。模板纯度对PCR的影响：分子生物学的各类研究，通常需获得高纯度的DNA，然而在中药飘扬的RAPD研究中，当模板中含有一定量的杂质时，并不影响扩增结果。模板浓度对PCR的影响：对PCR有一定影响，但在一定范围内其扩增结果基本相同。反应介质：BSA能影响PCR扩增结果，不加BSA虽能进行的增，但其条带数少于加少BSA的反应。BSA浓度在0.5-2.0g/l其条带基本一致。此外根据经验，中药材的RAPD扩增Tap酶通常须1.5U/25uL以上方能进行较好扩增，这可能与各厂家Tap酶活性和我们提取的模板中带有某些抑制成分有关。Mg2+、dNTP对扩增结果影响不大，主要是对弱带的影响。
3.3引物的筛选问题商品中药材基因组DNA降解程度差别较大，但合适的引物可得到基本一致的DNA指纹图谱。通常RAPD的产物在200.3000bp形成指纹图，但能使中药材扩增出200.1500bp条带的引物较为合适，因为在此范围内，不同时间样品易出现相同条带即重现性好。
3.4扩增条件在其他参数条件相同时，样品DNA降解相对较为重的模板，在用某些引物扩增时，反应循环数要适应增加，才能得到有效扩增。
3.5污染由于PCR的强大功能与检测的灵敏性，极微量的污染便可导致假阳性结果。故每次PCR反应一定要设立阴性对照孔，检测污染情况。
4小结与展望
中药走向世界，质量保证是一个重要的方面。DNA分子遗传标记技术在中药鉴定及其相关研究方面具有独到的优势和广阔的应用前景，但目前尚处于探索阶段。各种DNA分子遗传技术存在一定的局限性，有待进一步规范和完善。利用DNA分子遗传标记技术，开发有关药用动物遗传背景与化学成分相关性的研究，实现中药品种——质量标准化、基因工程生产天然活性成分寻找和扩大新药源；开发中药重要性状包括品质、产量和抗性的分子标记，实现中药材分子育种及品质人工调控，将是中药分子鉴定学的挑战又是现实意义的大课题。
参考文献
[1]曹晖，毕培曦，邵鹏柱.香港市售蒲公英及其混淆品蒲公英的DNA指纹鉴别研究[J].中国中药杂志，1997，22（4）：197.
[2]李军，郭晏海，秦雪梅.DNA随机扩增多态性分析技术在枸杞道地药材鉴定中的应用[J].中医药研究，2002，18（3）：48-49.
[3]王朝晖，李劲平，王培训.不同产地穿心莲药材的RAPD鉴别初步研究[J].中医药导报，2006，12（5）：4-5，8.
[4]王培训，黄丰，等.商品西洋参DNA指纹图谱鉴别[J].中药新药与临床药理，1999，10（6）：367.