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摘 要：为了研究硃砂烟叶特征“糯米香”风味的物质基础，采用同时蒸馏萃取-气相色谱-质谱法分析了硃砂烟叶（云烟87变异株）及其对照（云烟87）的香气物质特征。结果发现，在检出的114种香气成分中，硃砂烟的平均香气物质含量是对照烟叶的2.5倍，硃砂烟中含量高于对照烟叶的化合物有96种，其中有52种香气物质的平均变化倍率（硃砂/对照）大于1.5。这些化合物主要来自非酶棕色化反应和类胡萝卜素降解，是烟叶主体香味的重要组成部分。与文献数据比对发现本试验与相关文献有21种共同检出的香气物质，其中16种香气物质在本试验和文献数据中均表现为硃砂烟中含量高于对照烟。试验还发现麦斯明、3-氧代-a-紫罗兰酮、糠醇、2-环戊烯-1，4-二酮、面包酮、吡啶-3-甲醛以及未知物18的含量分布存在对照烟叶<浅色硃砂烟<深色硃砂煙的规律，说明硃砂烟的颜色深浅可能与这些香气成分的含量有关。香气物质含量的总体提高可能是硃砂烟形成其特征“糯米香”的物质基础。
关键词：硃砂烟;香气;巨豆三烯酮;气相色谱;质谱
Abstract： Flavor compounds screening of cherry-red tobacco leaf and normal flue-cured tobacco leaf was performed to elucidate the chemical basis of the “glutinous rice flavor” of cherry-red tobacco leaf. One hundred and fourteen flavor compounds were detected and the average content of these compounds in cherry-red tobacco was 2.5 times of that of the control. There were 96 compounds with higher concentration in the cherry-red tobacco than the control， of which， 52 compounds with fold-change （cherry-red/control） more than 1.5 were identified. These compounds， mostly from the Maillard reaction and the decomposition of carotenoids， are very important contributors of the dominant flavor of tobacco. The results of this study were compared with published references and 21 common compounds were extracted. Collectively higher concentrations in cherry-red tobacco for 16 of the common compounds were discovered. The relationship between the level of the red color of the cherry-red tobacco and the concentration of the flavor compounds was also studied. The concentration of myosmine， 3-oxo-a-ionone， 2-hydroxymethyl-furan， 2-Cyclopentene-1，4 -dione， 2-methyltetrahydrofuran-3-one， nicotinaldehyde， and the unknown compound 18 were found to have the lowest concentration in the control and the highest concentration in the dark cherry-red， indicating that the concentration of these compounds maybe related to the color of the cherry-red tobacco. The elevated concentration of the detected flavor compounds may account for the basis of the “glutinous rice flavor”.
Keywords： cherry-red tobacco; flavor; megastigmatrienone; gas chromatography; mass spectrometry
硃砂烟是烤烟的尼古丁转化株，即烤烟中能将大部分尼古丁转化为降烟碱的突变植株[1-3]。硃砂烟在国外被称为“樱红烟”，最早报道于20世纪50年代[4-5]，因其特殊的“糯米香”风味而受到卷烟工业的持续关注。硃砂烟烟叶的尼古丁含量较低、去甲基尼古丁和麦斯明含量较高等特征已明确，而决定其吸食风味的香气物质特征尚不明确。目前，关于硃砂烟香气特征的研究报道极少，仅见刘哲等[6]采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱分析硃砂烟香气特征。由于顶空固相微萃取技术本身的特点，该报道的硃砂烟香气成分中缺乏了以新植二烯、西柏三烯二醇、3-羟基-β大马酮等为代表的烟叶中基础香气成分的数据。而同时蒸馏萃取是提取烟叶挥发性香气成分最经典的方法[7-9]。因此，有必要以同时蒸馏萃取为提取方法对硃砂烟和普通烤烟的香气成分进行更加广泛的比较，以全面获得硃砂烟的香气特征。 本研究采用同时蒸馏萃取-气相色谱质谱法分析砂烟和对照烟叶中的香气成分，解析硃砂烟的香气特征，并通过不同颜色硃砂烟之间的香气物质比较，探索与硃砂烟颜色深浅相关的香气成分。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent 7890气相色谱配5977四极杆质谱仪（美国Agilent公司）;改进型同时蒸馏萃取仪（N-SDE）（国家烟草质量监督检验中心）;定量浓缩仪（Syncore-y-6，瑞士BUCHI公司）;二氯甲烷，分析纯。
1.2 样品与标样
本试验采用的烟叶样品为2020年云南省曲靖市和玉溪市采收的烤后硃砂烟（云烟87变异种）及对照（云烟87）的中部烟叶。其中硃砂烟和对照烟种于同一地块，土壤和栽培管理相同。各处理烟叶正常成熟采烤后分别取1 kg烟叶，去主脉后40 ℃条件下干燥4 h，粉碎过40目筛并于4 ℃冰箱密封保存备用。
标准样品包括1-戊烯-3-酮、3-甲基-1-丁醇、己醛、面包酮、3-甲基-2-丁烯醛、糠醛、糠醇、3，4-二甲基-2，5-二氢呋喃、5-甲基糠醇、苯甲醛、2-环戊烯-1，4-二酮、苯甲醇、苯乙醛、2-乙酰吡啶、6-甲基-5-庚烯-二酮、2-乙酰基吡咯、苯乙醇、二氢猕猴桃内酯、香叶基丙酮、新植二烯、3-羟基-茄那士酮、巨豆三烯酮、氧化异佛尔酮、2，6-壬二烯醛、2-异丙基-5氧-己醛、2，3-二氢苯并呋喃、吲哚、β-大马酮、β-二氢大马酮、β-环柠檬醛、茄酮、降茄二酮、5，6-环氧-β-紫罗兰酮、戊醛、3-羟基-2-丁酮、2，3-戊二酮、茄那士酮等，纯度大于98%。内标，正十七烷。0#柴油购自云南省玉溪市红塔区中国石化加油站，用于计算香气物质的线性保留指数。
1.3 样品前处理方法
采用文献[10]方法进行样品提取。准确称量20.00 g样品，放入1 L的圆底烧瓶，同时加入350 mL蒸馏水和1 mL 20.0 μg/mL正十七烷内标溶液。向100 mL平底烧瓶中加入60 mL二氯甲烷作为萃取溶剂。将以上1 L和100 mL烧瓶分别安装到同时蒸馏萃取装置的萃取端和蒸馏端，用电热套加热蒸馏端烧瓶至沸腾，60 ℃水浴下加热萃取端烧瓶，待蒸馏和萃取平衡后开始计时，提取2.5 h。将得到的二氯甲烷提取液加入10 g无水硫酸钠进行过夜干燥。干燥后的萃取液转至定量浓缩仪进行浓缩并定容至1.0 mL，转入气相色谱进样小瓶，以备分析。
1.4 GC-MS试验条件
色谱条件：色谱分析柱为DB-5MS（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）;程序升温条件为50 ℃保持1 min，5 ℃/min 升至160 ℃，保持2 min;5 ℃/min 升至270 ℃，保持6 min;进样口温度保持为250 ℃;载气为氦气;进样体积为1 μL;柱流量为1.0 mL/min;分流比为20∶1。
质谱条件：溶剂延迟时间为1.9 min;质量扫描范围为m/z 35～400;传输线温度为230 ℃;质谱数据采集频率为2 Hz。
1.5 数据处理
采用MS-DIAL数据处理系统[11-12]进行色谱峰识别、峰匹配、噪音过滤、定量比较和定性鉴定。采用AMDIS和NIST MS Search 2.0进行辅助结构鉴定，质谱和保留指数数据库来自NIST 2017 mainlib和Wiley registry8e。为了剔除试验误差和可能存在的随机相关，试验将玉溪和曲靖两地硃砂烟和对照烟中变化倍率（硃砂/对照）均大于1且两地平均值大于1.5的化合物作为硃砂烟含量显著高于对照的化合物，将变化倍率均小于1且两地平均值小于0.5的化合物作为硃砂烟含量显著低于对照的化合物，将其余的化合物作为非显著差异化合物。
2 结 果
2.1 硃砂烟和对照烤烟香气成分的整体差别
试验通过质谱库、保留指数等手段共鉴定出98种香气成分，其中醛酮类占45%，醇类占19%，烃类占12%，含氮化合物占11%（图1 A）。另外，本试验中还检测到16种含量显著差异的未知化合物。对这114种化合物在硃砂烟和对照烟间的含量分布进行研究发现，硃砂烟的香气物质平均含量是对照烟叶的2.5倍。从化合物含量的变化倍率（硃砂/对照）来看，硃砂烟中含量低于对照的化合物仅占16%，而硃砂烟中含量高于对照的化合物则占84%（图1 B），可见硃砂烟相对普通烤烟整体香气成分含量更高。硃砂烟整体香气物质含量高于对照烤烟可能是其特征“糯米香”风味的物质基础。
2.2 硃砂烟的特征香气化合物
由表1看出，有52種香气物质其含量在硃砂烟中显著高于对照烤烟，占所有被检测香气成分的45.6%。这些化合物中变化最大的是麦斯明，平均变化倍率达到41.1。麦斯明含量的升高是由于硃砂烟中尼古丁大量转化成去甲基尼古丁，而去甲基尼古丁很容易脱氢形成麦斯明。同样我们还发现以2，3-环戊烯并吡啶（变化倍率8.3）为代表的很多含氮化合物以及部分未鉴定出的化合物有很高的变化倍率，这些化合物很可能和麦斯明一样，是去甲基尼古丁的初级或次级代谢物。试验发现醛酮、醇、酯类化合物等物质的变化倍率大致集中在1.5～5之间，并未出现生物碱（含氮化合物）和部分未知化合物（可能也是生物碱）那样大的变化倍率。说明这些物质的代谢途径与以尼古丁和去甲基尼古丁为代表的生物碱代谢途径存在着一定的关联，但这些关联相对麦斯明等物质与去甲基尼古丁的关联要弱一些。
醛酮类化合物一方面来自还原糖和氨基酸之间的非酶棕色反应，另一方面来自类胡萝卜素的降解。以糠醛、5-甲基糠醛、糠醇、面包酮为代表的醛酮类化合物含量的上升说明烟碱向降烟碱的转化对糖类代谢或氨基酸代谢也产生了影响。而β-大马酮、3-羟基-β-大马酮、香叶基丙酮、巨豆三烯酮均来自类胡萝卜素的降解，硃砂烟中这些化合物含量的升高说明烟碱向降烟碱的转化也影响了类胡萝卜素的代谢途径。 2.3 硃砂烟中含量较低的化合物
硃砂烟含量显著低于对照的化合物仅有尼古丁（平均变化倍率0.4）和未知物5（保留指数1751，质谱特征离子173，平均变化倍率0.2）。由于硃砂烟中尼古丁含量显著下降，硃砂烟作为低烟碱高香气卷烟的原料将具有重要的意义。
2.4 硃砂烟与对照烤烟的共同香气化合物
试验共鉴定出60种含量无显著性变化的化合物（表2）。这些香气物质一部分在玉溪样品组和曲靖样品组中的变化趋势一致，但变化较小（变化倍率在1附近）。这些化合物的合成或分解代谢整体受烟碱向降烟碱转化的影响较小，为烤烟中含量稳定的香气成分，属于硃砂烟与普通烤烟的共同香气化合物。另一部分香气成分（如2，3-联吡啶和2，3-二氢苯并呋喃）在玉溪样品组和曲靖样品组中的变化趋势相反，且变化很大。这些化合物的含量变化可能受外部环境的影响更大，也不属于硃砂烟的特征香气成分。
2.5 试验结果与文献数据比对
将本试验得到的差异香气成分与文献数据进行对比，两种方法共检出21种共同的化合物（表3）。从整体上看，本试验中21种化合物的平均变化倍率为3.6，而文献数据中的平均变化倍率为6.0。从香气物质个体看，苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、2-乙酰基吡咯、尼古丁、麦斯明、3-羟基-2-丁酮、苯甲醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、癸醛、β-大马酮、香叶基丙酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯等化合物在本试验玉溪和曲靖样本中以及文献报道[7]的试验结果中均表现出在硃砂烟中的含量高于对照的特征，说明硃砂烟中这些化合物的含量分布规律具有很高的可靠性。同时，试验也发现异戊醇、糠醇、苯乙醛、正壬醛、茄酮等化合物在本试验中的分布规律与文献不一致，这些化合物在硃砂烟中的含量分布还需要更多数据的支撑。
2.6 与硃砂烟颜色深浅相关的香气物质
对曲靖种植的硃砂烟烤后叶进行颜色分类，得到硃砂浅色和深色的两组样品。对比分析对照样品（颜色最浅）、浅色硃砂烟和深色硃砂烟中香气成分的差异（图2），发现麦斯明、3-氧代-a-紫罗兰酮、糠醇、2-环戊烯-1，4-二酮、面包酮、吡啶-3-甲醛以及未知物18（保留指数2365，定量离子189）的含量分布均存在深色硃砂>浅色硃砂>对照的规律，而尼古丁的含量分布则为深色硃砂<浅色硃砂<对照，说明硃砂烟颜色的深浅可能与这些化合物的含量有关。
3 讨 论
3.1 “糯米香”与香气物质含量之间的关系
硃砂烟最令人印象深刻的是其“糯米香”风味，这种风味普通烤烟不具有。但烤烟某种吸食风味的形成通常是多种挥发性化合物共同作用的结果。硃砂烟中类胡萝卜素降解产物和非酶棕色化反应产物的含量整体高于普通烤烟，而尼古丁等化合物的含量则显著低于普通烤烟。由于尼古丁主要影响卷烟的劲头，而类胡萝卜素降解产物和非酶棕色化反应产物等挥发性香气物质则通常被认为影响吸食风味，因此我们推测硃砂烟“糯米香”风味的形成可能是类胡萝卜素降解产物和非酶棕色化反应产物含量整体提高对吸食风味的综合影响。而硃砂烟中巨豆三烯酮、苯甲醛、苯乙醛、糠醛等主要香气物质含量的提升可能是“糯米香”风味的形成的重要原因。
从香气化合物对烟叶香味特征的贡献来看，硃砂烟中以巨豆三烯酮和香叶基丙酮为代表的香气成分对烟叶清甜香风格的彰显、增香去杂、提高香味品质等起到积极的作用[13-14]。
3.2 硃砂烟颜色深浅与香气物质的关系
硃砂烟的红色物质被认为是降烟碱和醌类物质反应形成的[15-16]，但其具体化学结构至今未确定。试验发现麦斯明、3-氧代-a-紫罗兰酮、糠醇、2-环戊烯-1，4-二酮、面包酮、吡啶-3-甲醛以及未知物18的含量分布均存在深色硃砂>浅色硃砂>对照的规律，而尼古丁的含量分布则为深色硃砂<浅色硃砂<对照，说明硃砂烟颜色深浅与这些物质存在相关关系。但硃砂烟的香气提取物与对照烟叶在颜色上没有显著性差别，说明香气物质并不包含硃砂烟的红色物质。本试验在对比不同提取溶剂对硃砂烟红色物质的提取效果时，发现与丙酮、氯仿、正己烷等试剂相比，纯水能更好的提取出硃砂烟与对照烟叶中的红色差别，说明朱砂红的化学基础是一种水溶性较好的物质，以上提到的18种香气物质虽含量与硃砂烟红色深浅有相关性，但不是引起硃砂烟红色的直接原因。红色物质的最终确定需要通过分离纯化和光谱、质谱等技术的联合使用来实现。
4 结 论
硃砂烟香气物质的整体含量大于对照烟叶，这些香气物质主要为非酶棕色化反应产物和类胡萝卜素降解产物。3-氧代-a-紫羅兰酮等8种香气物质的含量与硃砂烟的颜色成正相关关系，可能与硃砂烟颜色深浅有关。
参考文献
[1]CHAKRABARTI M， MEEKINS K M， GAVILANO L B， et al. Inactivation of the cytochrome P450 gene CYP82E2 by degenerative mutations was a key event in the evolution of the alkaloid profile of modern tobacco[J]. New Phytol， 2007， 175（3）： 565-574.
[2]HALL J L， WEYBREW J A， MANN T J. Conversion of nicotine to nornicotine in grafts between cherry-red tobacco[J]. Plant Physiology， 1964： 45-48.
[3]SIMINSZCKY B， DEWEY R E. 烟碱转化为去甲基烟碱的原理研究与遗传资源开发[J]. 中国烟草学报，2006，12（4）：65-66. SIMINSZCKY B， DEWEY R E. Research on the conversion of nicotine to nornicotine and the development of genetic resources[J]. Chinese Tobacco Science， 2006， 12（4）： 65-66.
[4]JEFFREY R N， TSO T C. Tobacco constituents， qualitative differences in alkaloid fraction of cured tobaccos[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1955， 3（8）： 680-682.
[5]WADA E. Conversion of nicotine to nornicotine in cherry red tobacco during flue-curing[J]. Tobacco Science， 1956， 62（2）： 118-119.
[6]劉哲，张凤梅，刘志华，等. 朱砂烟叶和普通烟叶香气成分的HS-SPME-GC/MS 对比分析和感官差异[J]. 烟草科技，2020，53（7）：54-61.
LIU Z， ZHANG F M， LIU Z H， et al. Comparative analysis of aroma components of cinnabar and common tobacco leaves by HS-SPME-GC/MS and their sensory differences[J]. Tobacco Science & Technology， 2020， 53（7）： 54-61.
[7]曹建敏，于卫松，黄建，等. 烤烟致香物质GCMS指纹图谱在产区识别中的应用[J]. 中国烟草科学，2014，35（6）：85-89.
CAO J M， YU W S， HUANG J， et al. Application of aroma component gc/ms fingerprint in identifying producing areas of flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2014， 35（6）： 85-89.
[8]薛宝燕，沈嘉，姜超强，等. 两种典型环境对烤烟香型风格及致香物质的影响[J]. 中国烟草科学，2016，37（3）：1-7.
XUE B Y， SHEN J， JIANG C Q， et al. Influence of two typical environments on flavor type and aroma substances of flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（3）： 1-7.
[9]高占勇，杨晶津，王慧，等. 打叶后不同片型烟片致香成分与其特征面积的函数关系[J]. 中国烟草科学，2019，40（6）：83-88.
GAO Z Y， YANG J J， WANG H， et al. Functional relationship between aroma component contents and characteristic areas in threshed tobacco strips of different chip-type[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（6）： 83-88.
[10]李勇，林茜，逄涛，等. 气相色谱质谱法定性定量分析烟叶挥发性香气成分[J]. 分析科学学报，2015，31（3）：372-378.
LI Y， LIN Q， PANG T， et al. Structure elucidation and quantitation evaluation of flavor components in tobacco leaf by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of analytical science， 2015， 31（3）： 372-378.
[11]TSUGAWA H， CAJKA T， KIND T， et al. MS-DIAL： data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis[J]. Nat Methods， 2015， 12（6）： 523-526.
[12]LAI Z， TSUGAWA H， WOHLGEMUTH G， et al. Identifying metabolites by integrating metabolome databases with mass spectrometry cheminformatics[J]. Nature Methods， 2018， 15（1）： 53-56.
[13]史宏志，刘国顺. 烟草香味学[M]. 北京：中国农业出版社，1998：258.
SHI H Z， LIU G S. Tobacco falvor[M]. Beijing： China Agricultural Press， 1998： 258.
[14]王瑞新. 烟草化学[M]. 北京：中国农业出版社，2003.
WANG R X. Tobacco chemistry[M]. Beijing： China Agricultural Press， 2003.
[15]WEEKS W W， CAMPOS M P， MOLDOVEANU S. Biochemical and model chemical reactions for the basis of red pigment in flue-cured tobacco[J]. J. Agric. Food Chem.， 1993， 41： 1321-1328.
[16]WEEKS W W， CAMPOS M P， MOLDOVEANU S. Pyrolysis of cherry red tobacco and 1-Deoxy-1-[（S）-2-（3-pyridyl）-1- pyrrolidinyl]-β-D-fructose （Pyranose and Furanose Isomers） amadori products of cherry red tobacco[J]. Agric. Food Chem.， 1995， 43： 2247-2253.
关键词：硃砂烟;香气;巨豆三烯酮;气相色谱;质谱
Abstract： Flavor compounds screening of cherry-red tobacco leaf and normal flue-cured tobacco leaf was performed to elucidate the chemical basis of the “glutinous rice flavor” of cherry-red tobacco leaf. One hundred and fourteen flavor compounds were detected and the average content of these compounds in cherry-red tobacco was 2.5 times of that of the control. There were 96 compounds with higher concentration in the cherry-red tobacco than the control， of which， 52 compounds with fold-change （cherry-red/control） more than 1.5 were identified. These compounds， mostly from the Maillard reaction and the decomposition of carotenoids， are very important contributors of the dominant flavor of tobacco. The results of this study were compared with published references and 21 common compounds were extracted. Collectively higher concentrations in cherry-red tobacco for 16 of the common compounds were discovered. The relationship between the level of the red color of the cherry-red tobacco and the concentration of the flavor compounds was also studied. The concentration of myosmine， 3-oxo-a-ionone， 2-hydroxymethyl-furan， 2-Cyclopentene-1，4 -dione， 2-methyltetrahydrofuran-3-one， nicotinaldehyde， and the unknown compound 18 were found to have the lowest concentration in the control and the highest concentration in the dark cherry-red， indicating that the concentration of these compounds maybe related to the color of the cherry-red tobacco. The elevated concentration of the detected flavor compounds may account for the basis of the “glutinous rice flavor”.
Keywords： cherry-red tobacco; flavor; megastigmatrienone; gas chromatography; mass spectrometry
硃砂烟是烤烟的尼古丁转化株，即烤烟中能将大部分尼古丁转化为降烟碱的突变植株[1-3]。硃砂烟在国外被称为“樱红烟”，最早报道于20世纪50年代[4-5]，因其特殊的“糯米香”风味而受到卷烟工业的持续关注。硃砂烟烟叶的尼古丁含量较低、去甲基尼古丁和麦斯明含量较高等特征已明确，而决定其吸食风味的香气物质特征尚不明确。目前，关于硃砂烟香气特征的研究报道极少，仅见刘哲等[6]采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱分析硃砂烟香气特征。由于顶空固相微萃取技术本身的特点，该报道的硃砂烟香气成分中缺乏了以新植二烯、西柏三烯二醇、3-羟基-β大马酮等为代表的烟叶中基础香气成分的数据。而同时蒸馏萃取是提取烟叶挥发性香气成分最经典的方法[7-9]。因此，有必要以同时蒸馏萃取为提取方法对硃砂烟和普通烤烟的香气成分进行更加广泛的比较，以全面获得硃砂烟的香气特征。 本研究采用同时蒸馏萃取-气相色谱质谱法分析砂烟和对照烟叶中的香气成分，解析硃砂烟的香气特征，并通过不同颜色硃砂烟之间的香气物质比较，探索与硃砂烟颜色深浅相关的香气成分。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent 7890气相色谱配5977四极杆质谱仪（美国Agilent公司）;改进型同时蒸馏萃取仪（N-SDE）（国家烟草质量监督检验中心）;定量浓缩仪（Syncore-y-6，瑞士BUCHI公司）;二氯甲烷，分析纯。
1.2 样品与标样
本试验采用的烟叶样品为2020年云南省曲靖市和玉溪市采收的烤后硃砂烟（云烟87变异种）及对照（云烟87）的中部烟叶。其中硃砂烟和对照烟种于同一地块，土壤和栽培管理相同。各处理烟叶正常成熟采烤后分别取1 kg烟叶，去主脉后40 ℃条件下干燥4 h，粉碎过40目筛并于4 ℃冰箱密封保存备用。
标准样品包括1-戊烯-3-酮、3-甲基-1-丁醇、己醛、面包酮、3-甲基-2-丁烯醛、糠醛、糠醇、3，4-二甲基-2，5-二氢呋喃、5-甲基糠醇、苯甲醛、2-环戊烯-1，4-二酮、苯甲醇、苯乙醛、2-乙酰吡啶、6-甲基-5-庚烯-二酮、2-乙酰基吡咯、苯乙醇、二氢猕猴桃内酯、香叶基丙酮、新植二烯、3-羟基-茄那士酮、巨豆三烯酮、氧化异佛尔酮、2，6-壬二烯醛、2-异丙基-5氧-己醛、2，3-二氢苯并呋喃、吲哚、β-大马酮、β-二氢大马酮、β-环柠檬醛、茄酮、降茄二酮、5，6-环氧-β-紫罗兰酮、戊醛、3-羟基-2-丁酮、2，3-戊二酮、茄那士酮等，纯度大于98%。内标，正十七烷。0#柴油购自云南省玉溪市红塔区中国石化加油站，用于计算香气物质的线性保留指数。
1.3 样品前处理方法
采用文献[10]方法进行样品提取。准确称量20.00 g样品，放入1 L的圆底烧瓶，同时加入350 mL蒸馏水和1 mL 20.0 μg/mL正十七烷内标溶液。向100 mL平底烧瓶中加入60 mL二氯甲烷作为萃取溶剂。将以上1 L和100 mL烧瓶分别安装到同时蒸馏萃取装置的萃取端和蒸馏端，用电热套加热蒸馏端烧瓶至沸腾，60 ℃水浴下加热萃取端烧瓶，待蒸馏和萃取平衡后开始计时，提取2.5 h。将得到的二氯甲烷提取液加入10 g无水硫酸钠进行过夜干燥。干燥后的萃取液转至定量浓缩仪进行浓缩并定容至1.0 mL，转入气相色谱进样小瓶，以备分析。
1.4 GC-MS试验条件
色谱条件：色谱分析柱为DB-5MS（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）;程序升温条件为50 ℃保持1 min，5 ℃/min 升至160 ℃，保持2 min;5 ℃/min 升至270 ℃，保持6 min;进样口温度保持为250 ℃;载气为氦气;进样体积为1 μL;柱流量为1.0 mL/min;分流比为20∶1。
质谱条件：溶剂延迟时间为1.9 min;质量扫描范围为m/z 35～400;传输线温度为230 ℃;质谱数据采集频率为2 Hz。
1.5 数据处理
采用MS-DIAL数据处理系统[11-12]进行色谱峰识别、峰匹配、噪音过滤、定量比较和定性鉴定。采用AMDIS和NIST MS Search 2.0进行辅助结构鉴定，质谱和保留指数数据库来自NIST 2017 mainlib和Wiley registry8e。为了剔除试验误差和可能存在的随机相关，试验将玉溪和曲靖两地硃砂烟和对照烟中变化倍率（硃砂/对照）均大于1且两地平均值大于1.5的化合物作为硃砂烟含量显著高于对照的化合物，将变化倍率均小于1且两地平均值小于0.5的化合物作为硃砂烟含量显著低于对照的化合物，将其余的化合物作为非显著差异化合物。
2 结 果
2.1 硃砂烟和对照烤烟香气成分的整体差别
试验通过质谱库、保留指数等手段共鉴定出98种香气成分，其中醛酮类占45%，醇类占19%，烃类占12%，含氮化合物占11%（图1 A）。另外，本试验中还检测到16种含量显著差异的未知化合物。对这114种化合物在硃砂烟和对照烟间的含量分布进行研究发现，硃砂烟的香气物质平均含量是对照烟叶的2.5倍。从化合物含量的变化倍率（硃砂/对照）来看，硃砂烟中含量低于对照的化合物仅占16%，而硃砂烟中含量高于对照的化合物则占84%（图1 B），可见硃砂烟相对普通烤烟整体香气成分含量更高。硃砂烟整体香气物质含量高于对照烤烟可能是其特征“糯米香”风味的物质基础。
2.2 硃砂烟的特征香气化合物
由表1看出，有52種香气物质其含量在硃砂烟中显著高于对照烤烟，占所有被检测香气成分的45.6%。这些化合物中变化最大的是麦斯明，平均变化倍率达到41.1。麦斯明含量的升高是由于硃砂烟中尼古丁大量转化成去甲基尼古丁，而去甲基尼古丁很容易脱氢形成麦斯明。同样我们还发现以2，3-环戊烯并吡啶（变化倍率8.3）为代表的很多含氮化合物以及部分未鉴定出的化合物有很高的变化倍率，这些化合物很可能和麦斯明一样，是去甲基尼古丁的初级或次级代谢物。试验发现醛酮、醇、酯类化合物等物质的变化倍率大致集中在1.5～5之间，并未出现生物碱（含氮化合物）和部分未知化合物（可能也是生物碱）那样大的变化倍率。说明这些物质的代谢途径与以尼古丁和去甲基尼古丁为代表的生物碱代谢途径存在着一定的关联，但这些关联相对麦斯明等物质与去甲基尼古丁的关联要弱一些。
醛酮类化合物一方面来自还原糖和氨基酸之间的非酶棕色反应，另一方面来自类胡萝卜素的降解。以糠醛、5-甲基糠醛、糠醇、面包酮为代表的醛酮类化合物含量的上升说明烟碱向降烟碱的转化对糖类代谢或氨基酸代谢也产生了影响。而β-大马酮、3-羟基-β-大马酮、香叶基丙酮、巨豆三烯酮均来自类胡萝卜素的降解，硃砂烟中这些化合物含量的升高说明烟碱向降烟碱的转化也影响了类胡萝卜素的代谢途径。 2.3 硃砂烟中含量较低的化合物
硃砂烟含量显著低于对照的化合物仅有尼古丁（平均变化倍率0.4）和未知物5（保留指数1751，质谱特征离子173，平均变化倍率0.2）。由于硃砂烟中尼古丁含量显著下降，硃砂烟作为低烟碱高香气卷烟的原料将具有重要的意义。
2.4 硃砂烟与对照烤烟的共同香气化合物
试验共鉴定出60种含量无显著性变化的化合物（表2）。这些香气物质一部分在玉溪样品组和曲靖样品组中的变化趋势一致，但变化较小（变化倍率在1附近）。这些化合物的合成或分解代谢整体受烟碱向降烟碱转化的影响较小，为烤烟中含量稳定的香气成分，属于硃砂烟与普通烤烟的共同香气化合物。另一部分香气成分（如2，3-联吡啶和2，3-二氢苯并呋喃）在玉溪样品组和曲靖样品组中的变化趋势相反，且变化很大。这些化合物的含量变化可能受外部环境的影响更大，也不属于硃砂烟的特征香气成分。
2.5 试验结果与文献数据比对
将本试验得到的差异香气成分与文献数据进行对比，两种方法共检出21种共同的化合物（表3）。从整体上看，本试验中21种化合物的平均变化倍率为3.6，而文献数据中的平均变化倍率为6.0。从香气物质个体看，苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、2-乙酰基吡咯、尼古丁、麦斯明、3-羟基-2-丁酮、苯甲醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、癸醛、β-大马酮、香叶基丙酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯等化合物在本试验玉溪和曲靖样本中以及文献报道[7]的试验结果中均表现出在硃砂烟中的含量高于对照的特征，说明硃砂烟中这些化合物的含量分布规律具有很高的可靠性。同时，试验也发现异戊醇、糠醇、苯乙醛、正壬醛、茄酮等化合物在本试验中的分布规律与文献不一致，这些化合物在硃砂烟中的含量分布还需要更多数据的支撑。
2.6 与硃砂烟颜色深浅相关的香气物质
对曲靖种植的硃砂烟烤后叶进行颜色分类，得到硃砂浅色和深色的两组样品。对比分析对照样品（颜色最浅）、浅色硃砂烟和深色硃砂烟中香气成分的差异（图2），发现麦斯明、3-氧代-a-紫罗兰酮、糠醇、2-环戊烯-1，4-二酮、面包酮、吡啶-3-甲醛以及未知物18（保留指数2365，定量离子189）的含量分布均存在深色硃砂>浅色硃砂>对照的规律，而尼古丁的含量分布则为深色硃砂<浅色硃砂<对照，说明硃砂烟颜色的深浅可能与这些化合物的含量有关。
3 讨 论
3.1 “糯米香”与香气物质含量之间的关系
硃砂烟最令人印象深刻的是其“糯米香”风味，这种风味普通烤烟不具有。但烤烟某种吸食风味的形成通常是多种挥发性化合物共同作用的结果。硃砂烟中类胡萝卜素降解产物和非酶棕色化反应产物的含量整体高于普通烤烟，而尼古丁等化合物的含量则显著低于普通烤烟。由于尼古丁主要影响卷烟的劲头，而类胡萝卜素降解产物和非酶棕色化反应产物等挥发性香气物质则通常被认为影响吸食风味，因此我们推测硃砂烟“糯米香”风味的形成可能是类胡萝卜素降解产物和非酶棕色化反应产物含量整体提高对吸食风味的综合影响。而硃砂烟中巨豆三烯酮、苯甲醛、苯乙醛、糠醛等主要香气物质含量的提升可能是“糯米香”风味的形成的重要原因。
从香气化合物对烟叶香味特征的贡献来看，硃砂烟中以巨豆三烯酮和香叶基丙酮为代表的香气成分对烟叶清甜香风格的彰显、增香去杂、提高香味品质等起到积极的作用[13-14]。
3.2 硃砂烟颜色深浅与香气物质的关系
硃砂烟的红色物质被认为是降烟碱和醌类物质反应形成的[15-16]，但其具体化学结构至今未确定。试验发现麦斯明、3-氧代-a-紫罗兰酮、糠醇、2-环戊烯-1，4-二酮、面包酮、吡啶-3-甲醛以及未知物18的含量分布均存在深色硃砂>浅色硃砂>对照的规律，而尼古丁的含量分布则为深色硃砂<浅色硃砂<对照，说明硃砂烟颜色深浅与这些物质存在相关关系。但硃砂烟的香气提取物与对照烟叶在颜色上没有显著性差别，说明香气物质并不包含硃砂烟的红色物质。本试验在对比不同提取溶剂对硃砂烟红色物质的提取效果时，发现与丙酮、氯仿、正己烷等试剂相比，纯水能更好的提取出硃砂烟与对照烟叶中的红色差别，说明朱砂红的化学基础是一种水溶性较好的物质，以上提到的18种香气物质虽含量与硃砂烟红色深浅有相关性，但不是引起硃砂烟红色的直接原因。红色物质的最终确定需要通过分离纯化和光谱、质谱等技术的联合使用来实现。
4 结 论
硃砂烟香气物质的整体含量大于对照烟叶，这些香气物质主要为非酶棕色化反应产物和类胡萝卜素降解产物。3-氧代-a-紫羅兰酮等8种香气物质的含量与硃砂烟的颜色成正相关关系，可能与硃砂烟颜色深浅有关。
参考文献
[1]CHAKRABARTI M， MEEKINS K M， GAVILANO L B， et al. Inactivation of the cytochrome P450 gene CYP82E2 by degenerative mutations was a key event in the evolution of the alkaloid profile of modern tobacco[J]. New Phytol， 2007， 175（3）： 565-574.
[2]HALL J L， WEYBREW J A， MANN T J. Conversion of nicotine to nornicotine in grafts between cherry-red tobacco[J]. Plant Physiology， 1964： 45-48.
[3]SIMINSZCKY B， DEWEY R E. 烟碱转化为去甲基烟碱的原理研究与遗传资源开发[J]. 中国烟草学报，2006，12（4）：65-66. SIMINSZCKY B， DEWEY R E. Research on the conversion of nicotine to nornicotine and the development of genetic resources[J]. Chinese Tobacco Science， 2006， 12（4）： 65-66.
[4]JEFFREY R N， TSO T C. Tobacco constituents， qualitative differences in alkaloid fraction of cured tobaccos[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1955， 3（8）： 680-682.
[5]WADA E. Conversion of nicotine to nornicotine in cherry red tobacco during flue-curing[J]. Tobacco Science， 1956， 62（2）： 118-119.
[6]劉哲，张凤梅，刘志华，等. 朱砂烟叶和普通烟叶香气成分的HS-SPME-GC/MS 对比分析和感官差异[J]. 烟草科技，2020，53（7）：54-61.
LIU Z， ZHANG F M， LIU Z H， et al. Comparative analysis of aroma components of cinnabar and common tobacco leaves by HS-SPME-GC/MS and their sensory differences[J]. Tobacco Science & Technology， 2020， 53（7）： 54-61.
[7]曹建敏，于卫松，黄建，等. 烤烟致香物质GCMS指纹图谱在产区识别中的应用[J]. 中国烟草科学，2014，35（6）：85-89.
CAO J M， YU W S， HUANG J， et al. Application of aroma component gc/ms fingerprint in identifying producing areas of flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2014， 35（6）： 85-89.
[8]薛宝燕，沈嘉，姜超强，等. 两种典型环境对烤烟香型风格及致香物质的影响[J]. 中国烟草科学，2016，37（3）：1-7.
XUE B Y， SHEN J， JIANG C Q， et al. Influence of two typical environments on flavor type and aroma substances of flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（3）： 1-7.
[9]高占勇，杨晶津，王慧，等. 打叶后不同片型烟片致香成分与其特征面积的函数关系[J]. 中国烟草科学，2019，40（6）：83-88.
GAO Z Y， YANG J J， WANG H， et al. Functional relationship between aroma component contents and characteristic areas in threshed tobacco strips of different chip-type[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（6）： 83-88.
[10]李勇，林茜，逄涛，等. 气相色谱质谱法定性定量分析烟叶挥发性香气成分[J]. 分析科学学报，2015，31（3）：372-378.
LI Y， LIN Q， PANG T， et al. Structure elucidation and quantitation evaluation of flavor components in tobacco leaf by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of analytical science， 2015， 31（3）： 372-378.
[11]TSUGAWA H， CAJKA T， KIND T， et al. MS-DIAL： data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis[J]. Nat Methods， 2015， 12（6）： 523-526.
[12]LAI Z， TSUGAWA H， WOHLGEMUTH G， et al. Identifying metabolites by integrating metabolome databases with mass spectrometry cheminformatics[J]. Nature Methods， 2018， 15（1）： 53-56.
[13]史宏志，刘国顺. 烟草香味学[M]. 北京：中国农业出版社，1998：258.
SHI H Z， LIU G S. Tobacco falvor[M]. Beijing： China Agricultural Press， 1998： 258.
[14]王瑞新. 烟草化学[M]. 北京：中国农业出版社，2003.
WANG R X. Tobacco chemistry[M]. Beijing： China Agricultural Press， 2003.
[15]WEEKS W W， CAMPOS M P， MOLDOVEANU S. Biochemical and model chemical reactions for the basis of red pigment in flue-cured tobacco[J]. J. Agric. Food Chem.， 1993， 41： 1321-1328.
[16]WEEKS W W， CAMPOS M P， MOLDOVEANU S. Pyrolysis of cherry red tobacco and 1-Deoxy-1-[（S）-2-（3-pyridyl）-1- pyrrolidinyl]-β-D-fructose （Pyranose and Furanose Isomers） amadori products of cherry red tobacco[J]. Agric. Food Chem.， 1995， 43： 2247-2253.