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中图分类号 R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）14-1692-06
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.05
摘 要 目的：分析双环醇、联苯双酯和五味子丙素的质谱裂解规律，鉴定双环醇原料药中的杂质。方法：采用超高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间质谱法，以电喷雾电离源为离子源，在正离子模式下，利用飞行时间质谱对双环醇、联苯双酯和五味子丙素的准分子离子及其特征碎片离子信息进行分析，根据碎片质量变化推测可能的裂解途径，分析总结其质谱裂解规律;双环醇原料药样品首先通过液相色谱分离，寻找其中的杂质峰，然后利用质谱对杂质峰进行分析，结合裂解规律辅助鉴定杂质的结构。结果：3种化合物在正离子模式下均产生[M+H]+的准分子离子，经碰撞诱导解离后发生C—O键、C—C键的简单断裂以及氧环的开环断裂，并伴随以CH2O为主，CO2、CO、CHO为辅的中性碎片丢失，解离均集中在中高质量区。3种化合物只有支链结构和/或氧环结构发生C—C、C—O键的简单断裂，而联苯母核结构未曾改变。其中，双环醇由于含有苄位羟基結构，故在酸性流动相条件下，会以[M+H-H2O]+的形式稳定存在;五味子丙素因其含有八元环结构，故碰撞电压下率先出现开环，继而再出现中性碎片丢失。双环醇原料药中杂质的二级质谱与联苯双酯的二级碎片表现出的质谱裂解行为基本一致。结论：本研究归纳了3种五味子衍生物的质谱裂解规律。双环醇原料药中出现的杂质可能为联苯双酯。
关键词 双环醇;联苯双酯;五味子丙素;超高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间质谱;质谱裂解规律;杂质鉴定
UHPLC-ESI-Q-TOF-MS Analysis of Bicyclol， Bifendate and Schisandrin C and Application
DUAN Huajian1，2，WU Zhenghua2，YU Shidan3，WANG Shuowen2，CHEN Ming2，FAN Guorong1，2（1. School of Pharmacy， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 201100， China; 2. Dept. of Clinical Pharmacy， the First Affiliated People’s Hospital of Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200080， China; 3. Dept. of Pharmacy， No. 906 Hospital of the Joint Logistics Support Force of PLA， Zhejiang Ningbo 315040， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To analyze the mass spectrometry fragmentation regularity of bicyclol， bifendate and schisandrin C， and to identify the impurities of bicyclol raw material. METHODS： UHPLC-ESI-Q-TOF-MS method was adopted. Using electrospray ionization source， in positive ion mode， the excimer ion and characteristic fragments of bicyclol， bifendate and schisandrin C were analyzed by means of TOF-MS. According to the mass change of fragments， the possible fragmentation pathways were speculated， and the fragmentation regularity were analyzed and summarized. Bicyclol raw material sample was first separated by liquid chromatography to find the impurity peaks in it， and then the impurity peaks were analyzed by mass spectrometer; the impurity identification was conducted by combining with the fragmentation regularity. RESULTS： The 3 compounds all produced [M+H]+ excimer ion in the positive ion mode. After collision-induced dissociation， the C-O bond， the simple rupture of the C-C bond and the ring-opening cleavage of the oxygen ring occurred; with the loss of neutral fragments， mainly CH2O， supplemented by CO2， CO and CHO， the dissociation was concentrated in the middle and high quality regions. C-C and C-O bonds of 3 compounds were simply broken only in the branched chain structure and/or oxygen ring structure， but the structure of the biphenyl parent nucleus remained unchanged. Among them， the bicyclol contained a benzyl alcohol structure， so under acidic mobile phase conditions， it would exist stably in the form of [M+H-H2O]+. Because schisandrin C contained 8-membered ring structure， ring opening first occurred under collision voltage， and then neutral fragment loss occurred. The secondary mass spectra of impurity in bicyclol raw material were consistent with the mass spectra fragmentation of secondary fragments of bifendate. CONCLUSIONS： The study summarized mass spectrometry fragmentation regularity of 3 schisandrin derivatives. The impurity in bicyclol raw material may be bifendate. KEYWORDS Bicyclol; Bifendate; Schisandrin C; UHPLC- ESI-Q-TOF-MS; Mass spectrum fragmentation regularity; Impurity identification
五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.或华中五味子S. Sphenanthera Rehd. et Wils的干燥成熟果实。因其辛、甘、苦、涩、咸共生五味，故被称为五味子[1]。五味子的果实、种子含丰富的木脂素类化合物，如五味子醇，五味子甲素、乙素、丙素以及五味子酚等[2]。经研究发现，所有活性成分中五味子丙素（结构式见图1A）的保肝作用最强，但含量较低[3]。为此，研究者合成了五味子丙素及其衍生物，经筛选后，得到了易于合成且能够大规模生产的联苯双酯（结构式見图1B），该衍生物可显著下调乙肝患者的转氨酶水平，但具有停药反跳现象[4]。随后，经过结构优化，研究者合成了新的衍生物双环醇（结构式见图1C），该衍生物在延续联苯双酯保肝作用的同时，其停药反跳现象的发生率远低于联苯双酯，故在临床上得到了广泛应用[5-6]。
鉴于双环醇具有良好的保肝降酶作用，并且临床上应用广泛，因此研究其有关物质具有重要意义。双环醇有关物质的深入研究需通过高分辨质谱分析提供基础信息支撑。电喷雾-四极杆-飞行时间质谱（ESI-Q-TOF- MS）作为高分辨质谱，是通过软电离技术，在测定化合物精确分子量的同时，提供准确且丰富的碎片信息，尤其适用于未知化合物的结构鉴定[7]。该技术现已被广泛应用于中药、化学药和生物大分子等研究领域[8-10]。关于五味子类衍生物的结构鉴定，目前有贺锐锐等[11]采用Discovery Studio软件探究了五味子乙素质谱裂解途径，靳茂礼等[12]对五味子酯甲的代谢产物进行了鉴定，但现有研究并不全面。基于此，本研究采用超高效液相色谱（UHPLC）-ESI-Q-TOF-MS法，在正离子模式（ESI+）下，经碰撞诱导解离（CID）获取碎片的二级质谱信息，并以此初步推测五味子丙素、联苯双酯、双环醇的裂解途径，从而总结得到这3种化合物的裂解规律，再根据此初步鉴定双环醇杂质的结构，旨在为双环醇质量控制提供参考，也为其他五味子衍生物的结构分析奠定理论基础。
1 材料
1.1 主要仪器
本研究主要仪器包括Agilent 1290型UHPLC仪（配有G7120A型二元泵及内置脱气机、G7159B型自动进样器、G7116B型柱温箱、Mass Hunter 10.0在线分析软件）和G6545型Q-TOF型质谱仪（美国Agilent公司）、CPA-225D型电子天平（德国Satorius公司）、Centrifuge 5804R型冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）、SK5200H型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）、Research UV型超纯水机（上海和泰仪器有限公司）等。
1.2 主要药品与试剂
双环醇原料药（批号170657，纯度98.0%）购自北京协和药厂;联苯双酯对照品（批号100192-201504，纯度98.0%）购自中国食品药品检定研究院;五味子丙素对照品（批号MB6954，纯度98.0%）购自大连美仑生物技术有限公司;甲醇和乙腈均购自德国Merck公司，均为色谱纯;甲酸和乙酸铵均购自上海安谱实验科技有限公司，均为分析纯;其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为自制超纯水。
2 方法与结果
2.1 溶液的配制
精密称定双环醇原料药、联苯双酯对照品、五味子丙素对照品各10 mg，分别置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，超声（功率200 W，频率53 kHz，下同）10 min使完全溶解，得上述成分质量浓度均为1 mg/mL的贮备液，于4 ℃下储存。取上述贮备液适量，用80%甲醇梯度稀释制成质量浓度为1 μg/mL的标准溶液，临用现配。取上述3种样品的标准溶液各100 μL，置于同一EP管中，超声5 min使充分混匀，得到质量浓度均为0.33 mg/mL的混合标准溶液，备用。
2.2 UHPLC条件
以Dikma Diamonds C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱;以2 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸溶液为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱（0～1 min，40%B→70%B;1～4 min，70%B;4～4.5 min，70%B→95%B;4.5～8 min，95%B）;流速为1 mL/min;柱温为25 ℃;检测波长为276 nm;进样量为15 μL;分流比为3 ∶ 7。
2.3 质谱条件
离子源为ESI，扫描模式为ESI+;鞘气温度为350 ℃，流速为11 L/min;雾化温度为320 ℃，雾化气电压为35 psi;干燥气流速为8 L/min;锥孔电压为65 V;毛细管电压为175 V;碰撞电压为10～30 V;扫描范围为m/z 100～1 700。
2.4 色谱和质谱分析
吸取混合标准溶液100 μL，按照“2.2”“2.3”项下条件进样，先经UHPLC分离后再进入质谱分析。首先，由一级质谱提取离子流（EIC）图得到每个化合物的保留时间（RT）和准分子离子的精确m/z值;然后以准分子离子的m/z值作为靶m/z值，以RT前后0.5 min作为扫描时间范围，并在适宜碰撞电压下进行Target MS/MS扫描。经CID得到化合物的二级碎片，记录特征碎片离子信息，并根据碎片离子m/z值的变化情况，推测其可能的结构。
2.5 杂质鉴定
吸取双环醇标准溶液100 μL，按照“2.2”“2.3”项下条件进样分析，并以80%甲醇作为空白对照。首先经UHPLC的紫外（UV）检测，寻找除双环醇色谱峰以外的其他特征色谱峰，然后在一级质谱图中查找该色谱峰对应化合物的RT和m/z值。二级碎片采集操作同“2.4”项，根据得到的碎片信息结合质谱裂解规律进行杂质的初步鉴定。 2.6 软件辅助分析
采用Mass Hunter Qualitative Analysis 10.0软件对所有化合物的质谱数据进行采集和定性分析。首先，采用软件中的“generate formula”功能，通过限制C、H、O以及不饱和键的数量来确定特征峰对应化合物的分子式;然后，使用Molecular Structure Correclator 8.1软件，根据二级碎片离子信息并结合原型药的分子结构，对碎片离子的结构进行推测，以辅助裂解过程的推断（上述软件均来源于美国Agilent公司）。
3 结果与分析
3.1 3种化合物的色谱和质谱信息
色谱结果显示，双环醇、联苯双酯和五味子丙素的RT依次约为3.0、3.9、7.2 min，详见图2。
质谱结果显示，随着碰撞电压的增加，双环醇、联苯双酯和五味子丙素二级碎片数量也随之增加。在动态变化过程中，通过断裂时的电压推断支链结构的稳定性，对于分析支链断裂顺序具有重要的指导意义。分析二级质谱信息，以质量偏差（ppm）小于2×10-6、碎片响应值大于1×103为标准，归纳双环醇、联苯双酯和五味子丙素的主要特征碎片离子信息，详见表1～表3。
3.2 双环醇的质谱裂解途径
双环醇在ESI+下产生质子化离子m/z 391.034 1[M+H]+为其准分子离子峰。该成分C2位含苄位羟基，会脱去1分子H2O产生m/z 373.091 9的碎片离子，得到其二级质谱拟合图见图3。
双环醇的碎裂反应主要由CID引发[13]，由图3可知，裂解行为主要集中在中高质量区，在脱水得到的m/z 373.091 9的母离子基础上，首先C2′位酯键断裂丢失1分子CH2O，得到m/z 343.081 1的碎片离子。该碎片可继续于C2′、C4′位发生简单断裂丢失1分子CHO和1分子CH2O，得到m/z 314.078 4、284.067 4的碎片离子;也可于C5、C6位发生两个C—O键断裂，氧环开环后失去1分子CO2，得到m/z 299.091 4的碎片离子。该碎片有两种裂解方式，一种先开环后支链发生简单断裂，于C5、C6位开环断裂失去1分子CO，得到m/z 271.096 1的碎片离子，继而于C4′、C2′位发生两次简单断裂，先后得到m/z 241.049 1和m/z 213.090 9的碎片离子;另一种为C4′支链结构先发生简单断裂得到m/z 269.080 6的碎片离子，然后氧环开裂，最终也得到m/z 213.090 9的碎片离子。推测双环醇可能的裂解途径如图4所示。
3.3 联苯双酯的质谱裂解途径
联苯双酯在ESI+下产生质子化离子m/z 419.239 9
[M+H]+为其准分子离子峰，又经CID，得到其二级质谱拟合图见图5。
在ESI+下，联苯双酯得准分子离子峰[M+H]+，经CID共产生6个特征碎片，其裂解方式与双环醇相似，但过程更为简单。由图5可知，裂解行为主要集中在中高质量区，首先C2′位酯键断丢失1分子CH4O，得到m/z 387.070 6的碎片。该碎片有两种裂解方式，一种于C2、C4、C4′位发生连续C—O键的简单断裂，相继丢失1分子CH2O和1分子CHO，得到m/z 357.060 2和328.057 8的碎片离子;另一种是位于C5、C6位的氧环先开裂，丢失1分子CO2，得到m/z 343.081 3的碎片，随后C2、C4、C4′位发生简单断裂，形成m/z 313.034 3、285.075 7的碎片离子。推测联苯双酯可能的裂解途径如图6所示。
3.4 五味子丙素的质谱裂解途径
五味子丙素在ESI+下产生质子化离子m/z 385.164 6
[M+H]+为其准分子离子峰，又经CID，得到其二级质谱拟合图见图7。
由图5可知，五味子丙素经CID产生5个主要碎片离子峰。裂解过程与前人研究得到五味子乙素裂解的碎片情况基本相似[11]，亦与上述双环醇、联苯双酯的裂解行为类似。特殊之处在于五味子丙素含八元环结构，会发生2个C—C键的均裂脱，失去1分子C5H10使体系趋于稳定，得到m/z 315.089 3的碎片离子。从分子式水平分析，上述碎片离子的O原子数与母离子相同，而另一m/z 355.153 7的碎片离子的O原子数较母离子减少1，故通过O原子的变化情况可以推断出前一碎片离子由母离子直接得到。推测五味子丙素可能的裂解途径如图8所示。
3.5 杂质的鉴定结果
在对双环醇原料药进行色谱和质谱分析时，检测到1个杂质（图9），RT为3.846 min，该保留时间与联苯双酯的保留时间基本一致，为确定杂质成分，采用ESI-Q-TOF-MS做进一步的检测。
该杂质在ESI+下也产生m/z 419.240 5[M+H]+的准分子离子峰，经CID得到的二级质谱检测结果显示，该杂质共产生6个主要特征碎片离子，且碎裂集中在高质量区，拟合圖见图10。其中，该杂质产生m/z 387.071 1、357.060 5的碎片离子，与准分子离子差30和60，即连续丢失1分子或2分子CH2O，说明杂质中含有多个—OCH3结构;除此之外，还有m/z343.081 2、328.057 8、313.064 3、285.075 7的特征碎片离子，推测为上述2个碎片离子丢失CO2、CH2O、CHO、CO丢失所致。对比主要特征碎片，结合质量数推测中性碎片丢失情况，该杂质的二级质谱与联苯双酯的二级质谱碎片表现出的裂解行为完全一致。查阅相关文献证实，双环醇的合成工艺中采用联苯双酯作为起始原料[14-15]，因此极有可能在生产过程中引入联苯双酯，故可判断双环醇中出现的杂质可能为联苯双酯。
4 讨论
本实验前期分别在ESI+、负离子模式（ESI-）下，利用高分辨质谱探究了双环醇、联苯双酯、五味子丙素等3种化合物的质谱特征，并比较了其在不同碰撞电压（10、20、30、40 V）下的碎片丢失情况。结果显示，ESI-下的分子离子峰响应较ESI+低2个数量级，且离子丰度较低，故选用ESI+进行分析。由于40 V电压强度过高，在该条件下化合物被打碎且无特征碎片离子形成，因此选择在10～30 V的碰撞电压下采集二级碎片信息。 双环醇、联苯双酯、五味子丙素等3种化合物来源于中药五味子，具有相似的联苯结构，经CID可产生丰富的碎片信息，可初步鉴定其裂解途径，并为其他五味子衍生物的结构鉴定提供参考。3种化合物裂解过程有相同点和不同处，可相互补充。在ESI+模式下，3种化合物均产生了[M+H]+的准分子离子，其中双环醇因含有苄位羟基，容易脱水，故其准分子离子以[M+H-H2O]+的形式稳定存在。3种化合物的解离均集中在中高质量区。C2′位酯基易发生C—O键的均裂，由于化合物结构中含有多个—OCH3支链，因此会发生C—O键的简单断裂，从而导致多分子CH2O的丢失，基于化合物结构的特征性微小差异，裂解过程中还伴随CO2、CO、CHO等中性碎片的丢失。3种化合物中双键结构的β位均不含H，因此无法发生麦氏重排等复杂断裂。此外，联苯结构中两个苯环以单键直接相连的形式，会形成一个巨大的共轭体系，有利于降低分子势能而维持其稳定性[16]。因此在裂解过程中，3种化合物只有支链结构和/或氧环结构发生C—C、C—O键的简单断裂，而联苯母核结构均未改变。上述规律在3种化合物的质谱裂解过程中均存在，具有共性，即可归纳为3种五味子衍生物的质谱裂解规律。
对于双环醇原料药UHPLC-UV图谱中发现的杂质，通过色谱实现分离，再通过高分辨质谱对其二级碎片信息进行采集，经过对碎片的分析，发现其中性分子的丢失情况和质谱裂解行为与联苯双酯基本一致，符合上述工作中总结出的质谱裂解规律，得到的规律可以作为该种化合物杂质鉴定的辅助依据。
本实验采用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS法，通过对双环醇、联苯双酯和五味子丙素等3种五味子衍生物的质谱裂解途径进行研究，总结其质谱裂解规律，并将其用于辅助鉴定双环醇杂质的结构，这不仅对五味子衍生物有关物质的快速鉴定具有重要意义，也为后续药物代谢产物的分析鉴定提供了重要的理论支持。
参考文献
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（收稿日期：2021-04-18 修回日期：2021-06-09）
（编辑：邹丽娟）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.05
摘 要 目的：分析双环醇、联苯双酯和五味子丙素的质谱裂解规律，鉴定双环醇原料药中的杂质。方法：采用超高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间质谱法，以电喷雾电离源为离子源，在正离子模式下，利用飞行时间质谱对双环醇、联苯双酯和五味子丙素的准分子离子及其特征碎片离子信息进行分析，根据碎片质量变化推测可能的裂解途径，分析总结其质谱裂解规律;双环醇原料药样品首先通过液相色谱分离，寻找其中的杂质峰，然后利用质谱对杂质峰进行分析，结合裂解规律辅助鉴定杂质的结构。结果：3种化合物在正离子模式下均产生[M+H]+的准分子离子，经碰撞诱导解离后发生C—O键、C—C键的简单断裂以及氧环的开环断裂，并伴随以CH2O为主，CO2、CO、CHO为辅的中性碎片丢失，解离均集中在中高质量区。3种化合物只有支链结构和/或氧环结构发生C—C、C—O键的简单断裂，而联苯母核结构未曾改变。其中，双环醇由于含有苄位羟基結构，故在酸性流动相条件下，会以[M+H-H2O]+的形式稳定存在;五味子丙素因其含有八元环结构，故碰撞电压下率先出现开环，继而再出现中性碎片丢失。双环醇原料药中杂质的二级质谱与联苯双酯的二级碎片表现出的质谱裂解行为基本一致。结论：本研究归纳了3种五味子衍生物的质谱裂解规律。双环醇原料药中出现的杂质可能为联苯双酯。
关键词 双环醇;联苯双酯;五味子丙素;超高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间质谱;质谱裂解规律;杂质鉴定
UHPLC-ESI-Q-TOF-MS Analysis of Bicyclol， Bifendate and Schisandrin C and Application
DUAN Huajian1，2，WU Zhenghua2，YU Shidan3，WANG Shuowen2，CHEN Ming2，FAN Guorong1，2（1. School of Pharmacy， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 201100， China; 2. Dept. of Clinical Pharmacy， the First Affiliated People’s Hospital of Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200080， China; 3. Dept. of Pharmacy， No. 906 Hospital of the Joint Logistics Support Force of PLA， Zhejiang Ningbo 315040， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To analyze the mass spectrometry fragmentation regularity of bicyclol， bifendate and schisandrin C， and to identify the impurities of bicyclol raw material. METHODS： UHPLC-ESI-Q-TOF-MS method was adopted. Using electrospray ionization source， in positive ion mode， the excimer ion and characteristic fragments of bicyclol， bifendate and schisandrin C were analyzed by means of TOF-MS. According to the mass change of fragments， the possible fragmentation pathways were speculated， and the fragmentation regularity were analyzed and summarized. Bicyclol raw material sample was first separated by liquid chromatography to find the impurity peaks in it， and then the impurity peaks were analyzed by mass spectrometer; the impurity identification was conducted by combining with the fragmentation regularity. RESULTS： The 3 compounds all produced [M+H]+ excimer ion in the positive ion mode. After collision-induced dissociation， the C-O bond， the simple rupture of the C-C bond and the ring-opening cleavage of the oxygen ring occurred; with the loss of neutral fragments， mainly CH2O， supplemented by CO2， CO and CHO， the dissociation was concentrated in the middle and high quality regions. C-C and C-O bonds of 3 compounds were simply broken only in the branched chain structure and/or oxygen ring structure， but the structure of the biphenyl parent nucleus remained unchanged. Among them， the bicyclol contained a benzyl alcohol structure， so under acidic mobile phase conditions， it would exist stably in the form of [M+H-H2O]+. Because schisandrin C contained 8-membered ring structure， ring opening first occurred under collision voltage， and then neutral fragment loss occurred. The secondary mass spectra of impurity in bicyclol raw material were consistent with the mass spectra fragmentation of secondary fragments of bifendate. CONCLUSIONS： The study summarized mass spectrometry fragmentation regularity of 3 schisandrin derivatives. The impurity in bicyclol raw material may be bifendate. KEYWORDS Bicyclol; Bifendate; Schisandrin C; UHPLC- ESI-Q-TOF-MS; Mass spectrum fragmentation regularity; Impurity identification
五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.或华中五味子S. Sphenanthera Rehd. et Wils的干燥成熟果实。因其辛、甘、苦、涩、咸共生五味，故被称为五味子[1]。五味子的果实、种子含丰富的木脂素类化合物，如五味子醇，五味子甲素、乙素、丙素以及五味子酚等[2]。经研究发现，所有活性成分中五味子丙素（结构式见图1A）的保肝作用最强，但含量较低[3]。为此，研究者合成了五味子丙素及其衍生物，经筛选后，得到了易于合成且能够大规模生产的联苯双酯（结构式見图1B），该衍生物可显著下调乙肝患者的转氨酶水平，但具有停药反跳现象[4]。随后，经过结构优化，研究者合成了新的衍生物双环醇（结构式见图1C），该衍生物在延续联苯双酯保肝作用的同时，其停药反跳现象的发生率远低于联苯双酯，故在临床上得到了广泛应用[5-6]。
鉴于双环醇具有良好的保肝降酶作用，并且临床上应用广泛，因此研究其有关物质具有重要意义。双环醇有关物质的深入研究需通过高分辨质谱分析提供基础信息支撑。电喷雾-四极杆-飞行时间质谱（ESI-Q-TOF- MS）作为高分辨质谱，是通过软电离技术，在测定化合物精确分子量的同时，提供准确且丰富的碎片信息，尤其适用于未知化合物的结构鉴定[7]。该技术现已被广泛应用于中药、化学药和生物大分子等研究领域[8-10]。关于五味子类衍生物的结构鉴定，目前有贺锐锐等[11]采用Discovery Studio软件探究了五味子乙素质谱裂解途径，靳茂礼等[12]对五味子酯甲的代谢产物进行了鉴定，但现有研究并不全面。基于此，本研究采用超高效液相色谱（UHPLC）-ESI-Q-TOF-MS法，在正离子模式（ESI+）下，经碰撞诱导解离（CID）获取碎片的二级质谱信息，并以此初步推测五味子丙素、联苯双酯、双环醇的裂解途径，从而总结得到这3种化合物的裂解规律，再根据此初步鉴定双环醇杂质的结构，旨在为双环醇质量控制提供参考，也为其他五味子衍生物的结构分析奠定理论基础。
1 材料
1.1 主要仪器
本研究主要仪器包括Agilent 1290型UHPLC仪（配有G7120A型二元泵及内置脱气机、G7159B型自动进样器、G7116B型柱温箱、Mass Hunter 10.0在线分析软件）和G6545型Q-TOF型质谱仪（美国Agilent公司）、CPA-225D型电子天平（德国Satorius公司）、Centrifuge 5804R型冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）、SK5200H型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）、Research UV型超纯水机（上海和泰仪器有限公司）等。
1.2 主要药品与试剂
双环醇原料药（批号170657，纯度98.0%）购自北京协和药厂;联苯双酯对照品（批号100192-201504，纯度98.0%）购自中国食品药品检定研究院;五味子丙素对照品（批号MB6954，纯度98.0%）购自大连美仑生物技术有限公司;甲醇和乙腈均购自德国Merck公司，均为色谱纯;甲酸和乙酸铵均购自上海安谱实验科技有限公司，均为分析纯;其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为自制超纯水。
2 方法与结果
2.1 溶液的配制
精密称定双环醇原料药、联苯双酯对照品、五味子丙素对照品各10 mg，分别置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，超声（功率200 W，频率53 kHz，下同）10 min使完全溶解，得上述成分质量浓度均为1 mg/mL的贮备液，于4 ℃下储存。取上述贮备液适量，用80%甲醇梯度稀释制成质量浓度为1 μg/mL的标准溶液，临用现配。取上述3种样品的标准溶液各100 μL，置于同一EP管中，超声5 min使充分混匀，得到质量浓度均为0.33 mg/mL的混合标准溶液，备用。
2.2 UHPLC条件
以Dikma Diamonds C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱;以2 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸溶液为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱（0～1 min，40%B→70%B;1～4 min，70%B;4～4.5 min，70%B→95%B;4.5～8 min，95%B）;流速为1 mL/min;柱温为25 ℃;检测波长为276 nm;进样量为15 μL;分流比为3 ∶ 7。
2.3 质谱条件
离子源为ESI，扫描模式为ESI+;鞘气温度为350 ℃，流速为11 L/min;雾化温度为320 ℃，雾化气电压为35 psi;干燥气流速为8 L/min;锥孔电压为65 V;毛细管电压为175 V;碰撞电压为10～30 V;扫描范围为m/z 100～1 700。
2.4 色谱和质谱分析
吸取混合标准溶液100 μL，按照“2.2”“2.3”项下条件进样，先经UHPLC分离后再进入质谱分析。首先，由一级质谱提取离子流（EIC）图得到每个化合物的保留时间（RT）和准分子离子的精确m/z值;然后以准分子离子的m/z值作为靶m/z值，以RT前后0.5 min作为扫描时间范围，并在适宜碰撞电压下进行Target MS/MS扫描。经CID得到化合物的二级碎片，记录特征碎片离子信息，并根据碎片离子m/z值的变化情况，推测其可能的结构。
2.5 杂质鉴定
吸取双环醇标准溶液100 μL，按照“2.2”“2.3”项下条件进样分析，并以80%甲醇作为空白对照。首先经UHPLC的紫外（UV）检测，寻找除双环醇色谱峰以外的其他特征色谱峰，然后在一级质谱图中查找该色谱峰对应化合物的RT和m/z值。二级碎片采集操作同“2.4”项，根据得到的碎片信息结合质谱裂解规律进行杂质的初步鉴定。 2.6 软件辅助分析
采用Mass Hunter Qualitative Analysis 10.0软件对所有化合物的质谱数据进行采集和定性分析。首先，采用软件中的“generate formula”功能，通过限制C、H、O以及不饱和键的数量来确定特征峰对应化合物的分子式;然后，使用Molecular Structure Correclator 8.1软件，根据二级碎片离子信息并结合原型药的分子结构，对碎片离子的结构进行推测，以辅助裂解过程的推断（上述软件均来源于美国Agilent公司）。
3 结果与分析
3.1 3种化合物的色谱和质谱信息
色谱结果显示，双环醇、联苯双酯和五味子丙素的RT依次约为3.0、3.9、7.2 min，详见图2。
质谱结果显示，随着碰撞电压的增加，双环醇、联苯双酯和五味子丙素二级碎片数量也随之增加。在动态变化过程中，通过断裂时的电压推断支链结构的稳定性，对于分析支链断裂顺序具有重要的指导意义。分析二级质谱信息，以质量偏差（ppm）小于2×10-6、碎片响应值大于1×103为标准，归纳双环醇、联苯双酯和五味子丙素的主要特征碎片离子信息，详见表1～表3。
3.2 双环醇的质谱裂解途径
双环醇在ESI+下产生质子化离子m/z 391.034 1[M+H]+为其准分子离子峰。该成分C2位含苄位羟基，会脱去1分子H2O产生m/z 373.091 9的碎片离子，得到其二级质谱拟合图见图3。
双环醇的碎裂反应主要由CID引发[13]，由图3可知，裂解行为主要集中在中高质量区，在脱水得到的m/z 373.091 9的母离子基础上，首先C2′位酯键断裂丢失1分子CH2O，得到m/z 343.081 1的碎片离子。该碎片可继续于C2′、C4′位发生简单断裂丢失1分子CHO和1分子CH2O，得到m/z 314.078 4、284.067 4的碎片离子;也可于C5、C6位发生两个C—O键断裂，氧环开环后失去1分子CO2，得到m/z 299.091 4的碎片离子。该碎片有两种裂解方式，一种先开环后支链发生简单断裂，于C5、C6位开环断裂失去1分子CO，得到m/z 271.096 1的碎片离子，继而于C4′、C2′位发生两次简单断裂，先后得到m/z 241.049 1和m/z 213.090 9的碎片离子;另一种为C4′支链结构先发生简单断裂得到m/z 269.080 6的碎片离子，然后氧环开裂，最终也得到m/z 213.090 9的碎片离子。推测双环醇可能的裂解途径如图4所示。
3.3 联苯双酯的质谱裂解途径
联苯双酯在ESI+下产生质子化离子m/z 419.239 9
[M+H]+为其准分子离子峰，又经CID，得到其二级质谱拟合图见图5。
在ESI+下，联苯双酯得准分子离子峰[M+H]+，经CID共产生6个特征碎片，其裂解方式与双环醇相似，但过程更为简单。由图5可知，裂解行为主要集中在中高质量区，首先C2′位酯键断丢失1分子CH4O，得到m/z 387.070 6的碎片。该碎片有两种裂解方式，一种于C2、C4、C4′位发生连续C—O键的简单断裂，相继丢失1分子CH2O和1分子CHO，得到m/z 357.060 2和328.057 8的碎片离子;另一种是位于C5、C6位的氧环先开裂，丢失1分子CO2，得到m/z 343.081 3的碎片，随后C2、C4、C4′位发生简单断裂，形成m/z 313.034 3、285.075 7的碎片离子。推测联苯双酯可能的裂解途径如图6所示。
3.4 五味子丙素的质谱裂解途径
五味子丙素在ESI+下产生质子化离子m/z 385.164 6
[M+H]+为其准分子离子峰，又经CID，得到其二级质谱拟合图见图7。
由图5可知，五味子丙素经CID产生5个主要碎片离子峰。裂解过程与前人研究得到五味子乙素裂解的碎片情况基本相似[11]，亦与上述双环醇、联苯双酯的裂解行为类似。特殊之处在于五味子丙素含八元环结构，会发生2个C—C键的均裂脱，失去1分子C5H10使体系趋于稳定，得到m/z 315.089 3的碎片离子。从分子式水平分析，上述碎片离子的O原子数与母离子相同，而另一m/z 355.153 7的碎片离子的O原子数较母离子减少1，故通过O原子的变化情况可以推断出前一碎片离子由母离子直接得到。推测五味子丙素可能的裂解途径如图8所示。
3.5 杂质的鉴定结果
在对双环醇原料药进行色谱和质谱分析时，检测到1个杂质（图9），RT为3.846 min，该保留时间与联苯双酯的保留时间基本一致，为确定杂质成分，采用ESI-Q-TOF-MS做进一步的检测。
该杂质在ESI+下也产生m/z 419.240 5[M+H]+的准分子离子峰，经CID得到的二级质谱检测结果显示，该杂质共产生6个主要特征碎片离子，且碎裂集中在高质量区，拟合圖见图10。其中，该杂质产生m/z 387.071 1、357.060 5的碎片离子，与准分子离子差30和60，即连续丢失1分子或2分子CH2O，说明杂质中含有多个—OCH3结构;除此之外，还有m/z343.081 2、328.057 8、313.064 3、285.075 7的特征碎片离子，推测为上述2个碎片离子丢失CO2、CH2O、CHO、CO丢失所致。对比主要特征碎片，结合质量数推测中性碎片丢失情况，该杂质的二级质谱与联苯双酯的二级质谱碎片表现出的裂解行为完全一致。查阅相关文献证实，双环醇的合成工艺中采用联苯双酯作为起始原料[14-15]，因此极有可能在生产过程中引入联苯双酯，故可判断双环醇中出现的杂质可能为联苯双酯。
4 讨论
本实验前期分别在ESI+、负离子模式（ESI-）下，利用高分辨质谱探究了双环醇、联苯双酯、五味子丙素等3种化合物的质谱特征，并比较了其在不同碰撞电压（10、20、30、40 V）下的碎片丢失情况。结果显示，ESI-下的分子离子峰响应较ESI+低2个数量级，且离子丰度较低，故选用ESI+进行分析。由于40 V电压强度过高，在该条件下化合物被打碎且无特征碎片离子形成，因此选择在10～30 V的碰撞电压下采集二级碎片信息。 双环醇、联苯双酯、五味子丙素等3种化合物来源于中药五味子，具有相似的联苯结构，经CID可产生丰富的碎片信息，可初步鉴定其裂解途径，并为其他五味子衍生物的结构鉴定提供参考。3种化合物裂解过程有相同点和不同处，可相互补充。在ESI+模式下，3种化合物均产生了[M+H]+的准分子离子，其中双环醇因含有苄位羟基，容易脱水，故其准分子离子以[M+H-H2O]+的形式稳定存在。3种化合物的解离均集中在中高质量区。C2′位酯基易发生C—O键的均裂，由于化合物结构中含有多个—OCH3支链，因此会发生C—O键的简单断裂，从而导致多分子CH2O的丢失，基于化合物结构的特征性微小差异，裂解过程中还伴随CO2、CO、CHO等中性碎片的丢失。3种化合物中双键结构的β位均不含H，因此无法发生麦氏重排等复杂断裂。此外，联苯结构中两个苯环以单键直接相连的形式，会形成一个巨大的共轭体系，有利于降低分子势能而维持其稳定性[16]。因此在裂解过程中，3种化合物只有支链结构和/或氧环结构发生C—C、C—O键的简单断裂，而联苯母核结构均未改变。上述规律在3种化合物的质谱裂解过程中均存在，具有共性，即可归纳为3种五味子衍生物的质谱裂解规律。
对于双环醇原料药UHPLC-UV图谱中发现的杂质，通过色谱实现分离，再通过高分辨质谱对其二级碎片信息进行采集，经过对碎片的分析，发现其中性分子的丢失情况和质谱裂解行为与联苯双酯基本一致，符合上述工作中总结出的质谱裂解规律，得到的规律可以作为该种化合物杂质鉴定的辅助依据。
本实验采用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS法，通过对双环醇、联苯双酯和五味子丙素等3种五味子衍生物的质谱裂解途径进行研究，总结其质谱裂解规律，并将其用于辅助鉴定双环醇杂质的结构，这不仅对五味子衍生物有关物质的快速鉴定具有重要意义，也为后续药物代谢产物的分析鉴定提供了重要的理论支持。
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（收稿日期：2021-04-18 修回日期：2021-06-09）
（编辑：邹丽娟）