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[摘 要]采用等离子诱变技术，以泰妙菌素生产菌原生质体为诱变材料，对泰妙菌种TMII15-21进行诱变选育，通过筛选得到两株泰妙高单位菌株：TMII17-51、TMII17-68。经发酵摇瓶验证，其摇瓶效价分别高于出发菌株18.5%、20.2%。连续传代实验结果表明其传代稳定性良好。
[关键词]泰妙菌素；原生质体；等离子诱变；选育
中图分类号：S859.79+6 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）26-0197-01
泰妙菌种隶属于担子菌纲、伞菌目、斜盖伞属（Clitopilus prunulus），为双核真菌[1]。截短侧耳素是该菌属产生的次级代谢物之一，而截短侧耳素是合成延胡索酸泰妙菌素的前体物质。截短侧耳素为三环二萜类化合物，该物质合成的关键酶是二萜环化酶[2]。泰妙菌素产生菌遗传背景资料不足，尚不能应用基因工程手段对其进行特异性改造。
目前该菌种常用的育种方法为自然选育和诱变育种，以物理诱变居多。紫外诱变、紫外结合氯化锂诱变、紫外结合亚硝基胍诱变、重离子诱变，均有报道。等离子诱变是新型的物理诱变技术，能够在常温常压下开展，与传统的紫外诱变相比，能够造成更加多样的DNA损伤，突变率高，且易于获得遗传性状稳定的突变株[3]。因此，本研究采用等离子诱变开展本项目。
原生质体是等离子诱变的良好材料。相对于菌丝体而言，原生质体缺少细胞壁的保护，更有利于高能粒子进入细胞内部对基因组进行攻击，有利于提高突变率[4]。综上，本研究采用原生质体等离子诱变技术对泰妙菌株进行改造。这两项技术的结合有利于提高突变率，有利于获得产量性状发生重大变化的菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 泰妙菌素生产菌（Clitopilus prunulus），菌种号：TMII15-21，宁夏泰瑞制药股份有限公司菌种研究室保藏。
1.1.2 仪器与设备：LDZX-75KBS立式蒸汽压力灭菌器（上海申安医疗器械厂）、YT-CJ-2N双人双面净化工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司）、HZQ-F280全温振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂）、PSX智能型恒温恒湿培养箱（宁波莱福科技有限公司）、氦气常温常压等离子体（ARTP）诱变育种仪（北京思清源生物科技有限公司）。
1.1.3 培养基：种瓶培养基：马铃薯20%（浸提液）、葡萄糖4.2%、pH=6.3。
原生质体再生培养基：马铃薯20%（浸提液）、葡萄糖2%、琼脂1.56%、蔗糖2.7%、pH=6.5[5]。发酵瓶培养基：葡萄糖6%、玉米浆4%、硫酸镁0.05%、豆油2%。斜面培养基：马铃薯20%（浸提液）、葡萄糖2%、琼脂1.56%、pH=6.5。以上培养基均在121.0℃灭菌30min。
1.2 方法
1.2.1 原生質体制备
取培养72h的种子液30mL，3000r/min离心10min收集菌丝。将过滤除菌的酶液20mL加入到上述菌丝中，25℃酶解3～3.5h，期间每隔0.5h振荡混匀一次。最后用G2砂芯漏斗过滤，收集滤液[6]。
1.2.2 ARTP诱变
按上述方法得到的泰妙生产菌原生质体制备率可达1.5×106个/mL，制备10ml原生质体滤液，用移液吸取30ul涂至已灭菌的不锈钢载片上，将载片置于在载物台上，调整载物台高度设定为25mm、氦气流量8slpm、功率40W，分别照射30、60、90、120、150、180、210和240s。
将照射后的载片移至装有1ml磷酸盐缓冲溶液中，振荡30s，将附着在载片上的原生质体洗下，并稀释至10-1、10-2、10-33个梯度，每个梯度涂布5个再生培养基平板，25℃培养12天，以未照射滤液为对照，通过菌落计数法按下式计算致死率：致死率（%）=（N对-N诱）/N对*100，其中，N对为对照菌落数，N诱诱变处理后菌落数，绘制致死曲线图。同时，将不同照射时间的单菌落进行摇瓶验证，计算正突变率。
1.2.3 突变株的筛选
将诱变处理后的菌液稀释一定倍数后涂布于原生质体复苏平板中，25℃温度下培养12-15天后挑取圆形、白色、直径约为10mm的单菌落，接种于种瓶培养基中，25℃、培养120h后转入发酵培养基中，继续振荡培养216h后用HPLC方法测定其化学效价，根据初筛化学效价挑选较高的菌株进行复筛验证。最终根据复筛结果留取高单位菌株。
1.2.4 突变菌株稳定性验证
将已经选取的高单位菌株在斜面培养基中连续传代五次后进行发酵摇瓶验证，方法同上。根据摇瓶化学效价判定其遗传稳定性。
2 结果及讨论
2.1 照射时间的确定
当照射时间为30s时，致死率为37%，正突变率为19%；当照射时间为90s时，致死率为79%，正突变率为50%；照射时间为210s时，致死率为99%，正突变率为5%。致死率随着照射时间的增加逐渐升高，正突变率随着照射时间的增加先升高后降低。因此，选择照射时间为90s。
2.2 泰妙菌素生产菌高单位菌株选育
由上述实验确定照射时间为90s，在此条件下，挑选复苏后的单菌落208株，经初筛后，挑选效价单位高于出发菌株5%的菌株15株继续复筛验证。
初筛选出的15株菌株的复筛验证效价均高于对照菌株TMII15-21，其中51#、68#菌株分别高于对照18.5%、20.2%，且斜面外观正常，种子液质量合格。因此，保留51#、68#并进行传代稳定性验证。
2.3 泰妙菌素生产菌高单位菌株传代稳定性验证
将已选高单位菌株51#、68#连续传代至第五代，对其进行发酵摇瓶验证，并利用excel进行T-检验。 传代后经发酵摇瓶验证，各代之间摇瓶效价相差较小；同时，利用excel进行T-检验，各代之间的P值均大于0.05，说明各代之间无显著性差异；由此可见，51#、68#高单位菌株遗传稳定性良好，均可以作为生产菌株使用。
3 讨论与结论
利用等离子诱变技术，以泰妙生产菌原生质体为诱变材料，对泰妙菌种TMII15-21进行诱变选育，通过筛选得到两株泰妙高单位菌株：TMII17-51、TMII17-68。经发酵摇瓶验证，其摇瓶效价分别高于出发菌株18.5%、20.2%。连续传代实验结果表明其传代稳定性良好。
原生质体作为理想的诱变材料，相对于菌丝体而言，其诱变效率明显提高，该方法我们已经做了深入研究并能熟练的操作，为后续工作提供了基础。提高突变率。等离子诱变作为一种新型的物理诱变技术，与传统的紫外诱变相比，能够造成更加多样的DNA损伤，正突变率高，且易获得遗传性状稳定的突变株。使用该方法对泰妙生产菌进行选育，可以明显提高高单位菌株的选育效率。通过实践我们发现，等离子诱变技术比其他物理诱变方法操作简单、经济安全、效果理想，诱变后菌株验证化学效价有较高的提升，且稳定性良好，是一种很实用的物理诱变方法。
参考文献
[1] 陈晓丽，张文琦，胡昌华.高产截短侧耳素担子菌的抗性突变株筛选[J].中国生物工程杂志，2010，30（08）：67-71.
[2] 金学平，吴旭乾，阮建兵，等.截短侧耳素制备方法的研究概况[J].中国医药科学，2012，2（09）：69-70.
[3] 王忠中，张萍，石彦鹏，等.离子技术在弗氏链霉菌和侧耳属诱变选育中的应用[J].中国兽药杂志，2014，48（06）：15-18.
[4] 朱林东，金志华.普那霉素产生菌的原生质体诱变育种[J].中国抗生素杂志，2006，（10）：591-594+619.
[5] 孙金刚，杨智，牛春，等.响应面法优化泰妙菌素生产菌株原生质体再生培养基[J/OL].安徽农业科学，2016，44（36）：149-150+155.
[6] 楊智，孙金刚，牛春，等.泰妙菌素生产菌种原生质体制备条件优化[J/OL].安徽农业科学，2016，44（35）：5-7.
作者简介
孙金刚，男.学士，从事微生物菌种选育研究.
通讯作者：张萍，女，本科，主要从事微生物发酵研究.
[关键词]泰妙菌素；原生质体；等离子诱变；选育
中图分类号：S859.79+6 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）26-0197-01
泰妙菌种隶属于担子菌纲、伞菌目、斜盖伞属（Clitopilus prunulus），为双核真菌[1]。截短侧耳素是该菌属产生的次级代谢物之一，而截短侧耳素是合成延胡索酸泰妙菌素的前体物质。截短侧耳素为三环二萜类化合物，该物质合成的关键酶是二萜环化酶[2]。泰妙菌素产生菌遗传背景资料不足，尚不能应用基因工程手段对其进行特异性改造。
目前该菌种常用的育种方法为自然选育和诱变育种，以物理诱变居多。紫外诱变、紫外结合氯化锂诱变、紫外结合亚硝基胍诱变、重离子诱变，均有报道。等离子诱变是新型的物理诱变技术，能够在常温常压下开展，与传统的紫外诱变相比，能够造成更加多样的DNA损伤，突变率高，且易于获得遗传性状稳定的突变株[3]。因此，本研究采用等离子诱变开展本项目。
原生质体是等离子诱变的良好材料。相对于菌丝体而言，原生质体缺少细胞壁的保护，更有利于高能粒子进入细胞内部对基因组进行攻击，有利于提高突变率[4]。综上，本研究采用原生质体等离子诱变技术对泰妙菌株进行改造。这两项技术的结合有利于提高突变率，有利于获得产量性状发生重大变化的菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 泰妙菌素生产菌（Clitopilus prunulus），菌种号：TMII15-21，宁夏泰瑞制药股份有限公司菌种研究室保藏。
1.1.2 仪器与设备：LDZX-75KBS立式蒸汽压力灭菌器（上海申安医疗器械厂）、YT-CJ-2N双人双面净化工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司）、HZQ-F280全温振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂）、PSX智能型恒温恒湿培养箱（宁波莱福科技有限公司）、氦气常温常压等离子体（ARTP）诱变育种仪（北京思清源生物科技有限公司）。
1.1.3 培养基：种瓶培养基：马铃薯20%（浸提液）、葡萄糖4.2%、pH=6.3。
原生质体再生培养基：马铃薯20%（浸提液）、葡萄糖2%、琼脂1.56%、蔗糖2.7%、pH=6.5[5]。发酵瓶培养基：葡萄糖6%、玉米浆4%、硫酸镁0.05%、豆油2%。斜面培养基：马铃薯20%（浸提液）、葡萄糖2%、琼脂1.56%、pH=6.5。以上培养基均在121.0℃灭菌30min。
1.2 方法
1.2.1 原生質体制备
取培养72h的种子液30mL，3000r/min离心10min收集菌丝。将过滤除菌的酶液20mL加入到上述菌丝中，25℃酶解3～3.5h，期间每隔0.5h振荡混匀一次。最后用G2砂芯漏斗过滤，收集滤液[6]。
1.2.2 ARTP诱变
按上述方法得到的泰妙生产菌原生质体制备率可达1.5×106个/mL，制备10ml原生质体滤液，用移液吸取30ul涂至已灭菌的不锈钢载片上，将载片置于在载物台上，调整载物台高度设定为25mm、氦气流量8slpm、功率40W，分别照射30、60、90、120、150、180、210和240s。
将照射后的载片移至装有1ml磷酸盐缓冲溶液中，振荡30s，将附着在载片上的原生质体洗下，并稀释至10-1、10-2、10-33个梯度，每个梯度涂布5个再生培养基平板，25℃培养12天，以未照射滤液为对照，通过菌落计数法按下式计算致死率：致死率（%）=（N对-N诱）/N对*100，其中，N对为对照菌落数，N诱诱变处理后菌落数，绘制致死曲线图。同时，将不同照射时间的单菌落进行摇瓶验证，计算正突变率。
1.2.3 突变株的筛选
将诱变处理后的菌液稀释一定倍数后涂布于原生质体复苏平板中，25℃温度下培养12-15天后挑取圆形、白色、直径约为10mm的单菌落，接种于种瓶培养基中，25℃、培养120h后转入发酵培养基中，继续振荡培养216h后用HPLC方法测定其化学效价，根据初筛化学效价挑选较高的菌株进行复筛验证。最终根据复筛结果留取高单位菌株。
1.2.4 突变菌株稳定性验证
将已经选取的高单位菌株在斜面培养基中连续传代五次后进行发酵摇瓶验证，方法同上。根据摇瓶化学效价判定其遗传稳定性。
2 结果及讨论
2.1 照射时间的确定
当照射时间为30s时，致死率为37%，正突变率为19%；当照射时间为90s时，致死率为79%，正突变率为50%；照射时间为210s时，致死率为99%，正突变率为5%。致死率随着照射时间的增加逐渐升高，正突变率随着照射时间的增加先升高后降低。因此，选择照射时间为90s。
2.2 泰妙菌素生产菌高单位菌株选育
由上述实验确定照射时间为90s，在此条件下，挑选复苏后的单菌落208株，经初筛后，挑选效价单位高于出发菌株5%的菌株15株继续复筛验证。
初筛选出的15株菌株的复筛验证效价均高于对照菌株TMII15-21，其中51#、68#菌株分别高于对照18.5%、20.2%，且斜面外观正常，种子液质量合格。因此，保留51#、68#并进行传代稳定性验证。
2.3 泰妙菌素生产菌高单位菌株传代稳定性验证
将已选高单位菌株51#、68#连续传代至第五代，对其进行发酵摇瓶验证，并利用excel进行T-检验。 传代后经发酵摇瓶验证，各代之间摇瓶效价相差较小；同时，利用excel进行T-检验，各代之间的P值均大于0.05，说明各代之间无显著性差异；由此可见，51#、68#高单位菌株遗传稳定性良好，均可以作为生产菌株使用。
3 讨论与结论
利用等离子诱变技术，以泰妙生产菌原生质体为诱变材料，对泰妙菌种TMII15-21进行诱变选育，通过筛选得到两株泰妙高单位菌株：TMII17-51、TMII17-68。经发酵摇瓶验证，其摇瓶效价分别高于出发菌株18.5%、20.2%。连续传代实验结果表明其传代稳定性良好。
原生质体作为理想的诱变材料，相对于菌丝体而言，其诱变效率明显提高，该方法我们已经做了深入研究并能熟练的操作，为后续工作提供了基础。提高突变率。等离子诱变作为一种新型的物理诱变技术，与传统的紫外诱变相比，能够造成更加多样的DNA损伤，正突变率高，且易获得遗传性状稳定的突变株。使用该方法对泰妙生产菌进行选育，可以明显提高高单位菌株的选育效率。通过实践我们发现，等离子诱变技术比其他物理诱变方法操作简单、经济安全、效果理想，诱变后菌株验证化学效价有较高的提升，且稳定性良好，是一种很实用的物理诱变方法。
参考文献
[1] 陈晓丽，张文琦，胡昌华.高产截短侧耳素担子菌的抗性突变株筛选[J].中国生物工程杂志，2010，30（08）：67-71.
[2] 金学平，吴旭乾，阮建兵，等.截短侧耳素制备方法的研究概况[J].中国医药科学，2012，2（09）：69-70.
[3] 王忠中，张萍，石彦鹏，等.离子技术在弗氏链霉菌和侧耳属诱变选育中的应用[J].中国兽药杂志，2014，48（06）：15-18.
[4] 朱林东，金志华.普那霉素产生菌的原生质体诱变育种[J].中国抗生素杂志，2006，（10）：591-594+619.
[5] 孙金刚，杨智，牛春，等.响应面法优化泰妙菌素生产菌株原生质体再生培养基[J/OL].安徽农业科学，2016，44（36）：149-150+155.
[6] 楊智，孙金刚，牛春，等.泰妙菌素生产菌种原生质体制备条件优化[J/OL].安徽农业科学，2016，44（35）：5-7.
作者简介
孙金刚，男.学士，从事微生物菌种选育研究.
通讯作者：张萍，女，本科，主要从事微生物发酵研究.