论文部分内容阅读
目的 维生素E琥珀酸酯(vitamin E sucinate,VES)是天然维生素E衍生物中抑制肿瘤活性最强的一种,国内外研究已证实VES在体内外均能有效抑制肿瘤细胞生长,而对正常细胞无任何毒副作用.本研究旨在探讨VES是否通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)途径诱导胃癌细胞凋亡,及VES是否可促进人CD4+T淋巴细胞表达TRAIL及其受体,并探讨在体外联合应用VES与CD4+T淋巴细胞是否可增强对人胃癌细胞的凋亡诱导作用.方法 以中分化人胃癌MKN28细胞作为体外肿瘤模型.体外培养人胃癌MKN28细胞,用20 μg/mL VES处理胃癌细胞不同时间(0、6、12、18和24 h)后,流式细胞仪检测各组凋亡率;不同剂量(0、5、10和20 μg/mL) VES处理MKN28细胞12h,或10 μg/mL VES分别处理MKN28细胞不同时间(0～24 h)后,利用RT-PCR与蛋白质印迹法分别检测细胞内TRAIL受体DR4、DR5的mRNA和蛋白表达水平;用特异siRNA分别沉默人胃癌MKN28细胞DR4、DR5表达后,加入20 μg/mL VES处理细胞24 h,流式细胞仪检测各组凋亡率;不同剂量(0、5、10和20 μg/mL)VES处理人CD4+T细胞12h后,利用RT-PCR分析人CD4+T细胞中TRAIL和TRAIL受体的mRNA表达情况;将CD4+T细胞与胃癌细胞共培养后用20 μg/mL VES处理,将实验设置为对照组(Control)、CD4+T细胞作用组、VES作用组和CD4+T细胞+ VES联合作用组,光镜下观察细胞形态变化;并进行DAPI染色,荧光显微镜观察细胞核与染色质形态变化.结果 20 μg/mL VES处理胃癌细胞0、6、12、18和24 h,各组凋亡率分别为(2.8±0.46)％、(4.37±0.06)％、(7.27±0.64)％、(29.7±4.17)％和(42.02±2.35)％,不同作用时间组凋亡率之间差异有统计学意义,F=198.288,P＜0.001;RT-PCR及蛋白质印迹法结果显示,10 μg/mL VES作用下,DR4、DR5的mRNA和蛋白表达均呈先升高后降低的趋势,DR4、DR5的mRNA分别在9和6h处达到峰值,而蛋白表达在12 h达到峰值;用不同剂量VES作用胃癌细胞12 h,结果显示,细胞中TRAIL表达无变化,DR4、DR5蛋白表达升高,而DcR1、DcR2蛋白表达降低;用特异siRNA分别沉默人胃癌MKN28细胞DR4、DR5的表达后,加入20 μg/mL VES处理细胞24 h,各组细胞凋亡率分别为对照组(2.8±0.46)％、DR4 siRNA(3.23±0.25)％、DR5 siRNA(2.97±0.87)％、VES(42.02±2.35)％、VES+DR4 siRNA(14.00±0.61)％和VES+-DR5 siRNA(21.65±1.14)％,不同处理组凋亡率之间差异有统计学意义,F=528.344,P＜0.001;不同剂量VES处理人CD4+T细胞12h后,细胞中TRAIL的mRNA表达升高,而其他TRAIL受体表达无变化;将CD4+T细胞与胃癌细胞共培养后用20 μg/mL VES处理,与VES单独作用组相比,人CD4+T细胞与VES联合处理胃癌细胞后,细胞状态下降,染色质呈现凋亡形态细胞增多.结论 VES可通过TRAIL途径诱导胃癌细胞凋亡,VES可刺激人CD4+T细胞增强表达TRAIL,将CD4+T细胞与VES联合处理胃癌细胞,可增强胃癌细胞的凋亡.