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[摘要]目的：研究不同剂量5-氨基酮戊酸-光动力治疗（5-aminolevulinic acid photodynami c，ALA-PDT）对体外培养的人角质形成细胞增殖的影响和分泌生长因子的作用。方法：首先以噻唑蓝（methylthi azolyldiphenyl-tetrazo liumbromide，MTT）检测ALA-PDT对永生化人角质形成细胞（HaCaT细胞系）增殖的影响，再用相同的方法检测ALA-PDT对分离的人角质形成细胞（kerot inocyte，Kc）增殖的影响，最后vXELISA法检测ALA-PDT对Kc培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量的影响。结果：低剂量ALA-PDT（0.1mM和0.OlmM ALA，红光21J/cm2）能促进HaCaT细胞和人角质形成细胞的增殖；高剂量ALA-PDT（0.5mM ALA，红光21J/cm2）抑制其增殖。低剂量ALA-PDT干预24h后，bFGF分泌明显高于0.5mM ALA组和单纯红光组；而VEGF呈现24h时轻度下降，24h后明显增加的趋势。结论：高剂量ALA-PDT抑制角質形成细胞的增殖，甚至杀伤细胞；低剂量ALA-PDT能促进角质形成细胞的增殖，并且促进角质形成细胞分泌bFGF和VEGF。
[关键词]HaCaT细胞；角质形成细胞；光动力治疗；ALA-PDT；碱性成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子
[中图分类号]R339.38 Q813.1
[文献标志码]A
[文章编号]1008-645 5（2017）01-0013-03
光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）指的是在光敏剂参与下，以特定波长的光照射病灶区，产生氧化还原反应，生成各种高反应性的化学活性物质，达到治疗目的的新型治疗方法。5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是目前光动力局部治疗中最常用的光敏剂之一。应用PDT治疗疾病过程中，研究者们发现高剂量PDT可以杀灭肿瘤细胞和微生物，低剂量的则有抑制炎症，治疗光老化等作用。为了进一步了解低剂量光动力对人角质形成细胞的作用，本文拟研究不同剂量ALA-PDT对人角质形成细胞（kerotinocyte，Kc）增殖的影响和分泌细胞因子的作用。
1.材料和方法
1.1主要材料：改良1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品有限公司）、小牛血清（gibco，新西兰）、二甲基亚砜（DMSO，成都市科龙化工试剂厂）、Epilife培养基（gibco，Cascade Biologics）、磷酸缓冲盐溶液（PBS，北京中杉金桥）、分离酶（Roche，日本）、胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT，重庆索莱宝）、5氨基酮戊酸（北京英发康美）、ELISA试剂盒（上海依科赛生物制品有限公司）；LED IA光动力治疗仪（武汉亚格光技术有限公司）。
1.2HaCaT细胞的分离培养和传代：HaCaT细胞系来源于上海中科院细胞研究所，由本实验室冻存传代。用常规方法复苏细胞后，使用含5%小牛血清的改良1640培养基在37°C二氧化碳培养箱常规培养。细胞增殖至铺满80%左右时，使用胰蛋白酶常温下消化数分钟，小牛血清终止消化，常规方法传代。
1.3Kc的分离培养和传代：皮肤来源于正常男子包皮环切术后包皮组织。取全层皮肤用PBS反复漂洗后，除去脂肪和结缔组织。剪碎皮肤移入分离酶中，4°C过夜后分离表皮，热消化，1000rpm离心5min，加入Epilife培养基常规培养。细胞增殖至铺满80%左右时，使用胰蛋白酶冷消化，常规方法传代。
1.4实验分组与实验方法
1.4.1HaCaT细胞MTT实验：接种HaCaT细胞于3块24孔板，细胞密度40000个/孔，每块板均设4个组，A（ALAOmM，红光能量21J/cm2），B（ALA 0.01mM，红光能量21J/cm2），c（ALA0.1mM，红光能量21J/cm2），D（ALA0.5mM，紅光能量21J/cm2）。各组培养24h后，按分组加入ALA避光孵育30min，633nm红光照射，分别于0h、24h、48行MTT测A490值。
1.4.2人角质形成细胞MTT实验：接种角质形成细胞于3块96孔板，细胞密度104个/孔，分组和实验均同HaCaT细胞，最后也分别于0h、2411、48h行MTT测A490值。
1.4.3细胞因子ELISA检测：实验分组同人角质形成细胞MTT实验，每组培养24h，加入ALA避光孵育30min，633nm红光照射后，分别于0h、24h、48h收集细胞培养上清液，再按ELISA试剂盒说明书的方法，分别检测碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（YEW）的浓度。
1.5统计学方法：使用Excel和CurveExpert1.3软件进行曲线制作和分析，SPSSl9.0软件作单因素方差分析（P<0.05）。
2.结果
2.1角质形成细胞形态学观察：倒置显微镜下观察可见，表皮细胞接种24h内贴壁，细胞以圆形为主，随着时间的延长，细胞伸展成椭圆形、不规则形，体积变大。3d左右可见数个角质形成细胞形成的小集落，4周可见卫星样表皮细胞增殖。1周左右细胞汇合连接成片。0.5mM ALA-PDT干预48h后细胞部分脱离贴壁状态；其他浓度剂量的ALA-PDT干预后与单纯红光照射后相比未有明显不同。 2.2ALA-PDT对HaCaT细胞增殖的影响：结果可见，在PDT作用后24h和48h，低剂量AIA（0.1mM和0.01mM）预处理，PDT能促进HaCaT细胞的增殖（B、c组），且二者差异不大（P>0.05）；而当ALA浓度为0.5mM时，ALA-PDT明显抑制细胞增殖（P<0.05）（D组）（图1）。
2.2ALA-PDT对角质形成细胞（Kc）增殖的影响：结果可见，在ALA-PDT作用后24h和48h，低剂量ALA（0.1mM和0.01mM）预处理，PDT均能促进Kc的增殖（B、c组），且二者无明显差异（P>0.05）；而当ALA浓度为0.5mM时，ALAPDT抑制细胞增殖，且48h后抑制作用更明显（P<0.05）（D组）（图2）。
2.3ALA-PDT对角质形成细胞分泌bFGF和VEGF的影响：ELISA检测bFGF结果发现：当ALA-PDT作用后24h时，A、B、c各组bFGF浓度明显高于D组，而低剂量组（A、B组）的bFGF浓度升高最为明显。ELISA检测VEGF结果发现：当光照后24h，各组VEGF轻度下降；48h后，各组VEGF明显升高。
3.讨论
近年来，光动力治疗在皮肤科应用广泛，无论是在癌前病变还是肿瘤性疾病都取得一定的疗效，尤其是在日光性角化病、Bowen’s病、增殖性红斑、基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌等疾病中得到了较好的效果。同时，光动力治疗在一些非肿瘤性疾病如痤疮、尖锐湿疣等也疗效显著，能明显降低复发率。综合来看，光动力治疗大部分都应用在杀灭细菌和杀死肿瘤细胞的方面，其基本原理主要在于：①当光敏剂被组织摄取，暴露于适当波长的光，將从基态激活到激发态。激活的光敏剂可以形成自由基，然后与氧气产生活性氧（ROS）（I型反应）；也可以形成单线态氧（O2）（II型反应）；ROS与O2的氧化作用可以杀伤细胞和微生物，而光敏剂聚集越多的地方则杀伤作用愈强；②PDT可以激活多种免疫细胞和炎性细胞因子，产生杀伤作用。
目前，大部分的研究和应用都基于高剂量的光敏剂和高能量的光照，通过其杀伤作用达到治疗目的。但是最近的一些研究表明，低剂量光动力治疗其实有不同的效果，其有抑制炎症，治疗光老化等作用。本文的研究旨在探讨低剂量PDT对角质形成细胞的影响。结果发现，21J/cm2光照条件下，0.5mM ALA预处理与0.1mM和0.01mM ALA预处理后的结果有显著差异，0.5mM ALA-PDT组抑制角质形成细胞的增殖，而低剂量（0.1mM和O.01raM）ALA-PDT有不同程度的促进作用。
我们进一步用ELISA检测ALA-PDT对体外培养人角质形成细胞分泌bFGF和VEGF的影响。结果发现：①低剂量ALAPDT作用后24h和48h，人角质形成细胞分泌的bFGF高于高剂量组和单纯红光组；②ALA-PDT干预后，24h时，人角质形成细胞分泌VEGF的变化较小，48h时，各组的VEGF的含量明显上升，0.1mM和0.5mM组上升更明显。既往的研究中，Stachon等人。證明了以二氢卟吩E6为光敏剂，637nm红光（24J/cm2）照射人角膜细胞24h之后，VEGF有上升的趋势，但他们没有进一步研究干预48h后的变化。也有研究者发现PDT通过激活c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶通路和p38有丝分裂原激活蛋白酶通路诱导VEGF的表达。于是，我们推测低剂量PDT产生的低浓度的ROS，诱导了生物调节作用，也许能通过某些信号途径（如有丝分裂原激活蛋白酶通路）促进bFGF和VEGF的分泌，但是，两种生长因子的分泌规律并不与细胞增殖完全相同，提示还有其他因素起了重要作用，其中的具体机制和涉及的信号通路有待进一步实验阐明。
综上所述，本研究发现高剂量ALA-PDT抑制角质形成细胞的增殖，低剂量ALA-PDT则有利于其增殖，并且能促进其分泌bFGF和VEGF，但其规律和具体机制有待探讨。继续深入探索低剂量ALA-PDT作用的具体机制很有必要，对明确PDT这种全新治疗方法在不同条件下的不同生物学效应，并全面了解其作用原理有着重要的意义，更为拓展PDT的适应症奠定理论和实验基础。
[关键词]HaCaT细胞；角质形成细胞；光动力治疗；ALA-PDT；碱性成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子
[中图分类号]R339.38 Q813.1
[文献标志码]A
[文章编号]1008-645 5（2017）01-0013-03
光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）指的是在光敏剂参与下，以特定波长的光照射病灶区，产生氧化还原反应，生成各种高反应性的化学活性物质，达到治疗目的的新型治疗方法。5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是目前光动力局部治疗中最常用的光敏剂之一。应用PDT治疗疾病过程中，研究者们发现高剂量PDT可以杀灭肿瘤细胞和微生物，低剂量的则有抑制炎症，治疗光老化等作用。为了进一步了解低剂量光动力对人角质形成细胞的作用，本文拟研究不同剂量ALA-PDT对人角质形成细胞（kerotinocyte，Kc）增殖的影响和分泌细胞因子的作用。
1.材料和方法
1.1主要材料：改良1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品有限公司）、小牛血清（gibco，新西兰）、二甲基亚砜（DMSO，成都市科龙化工试剂厂）、Epilife培养基（gibco，Cascade Biologics）、磷酸缓冲盐溶液（PBS，北京中杉金桥）、分离酶（Roche，日本）、胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT，重庆索莱宝）、5氨基酮戊酸（北京英发康美）、ELISA试剂盒（上海依科赛生物制品有限公司）；LED IA光动力治疗仪（武汉亚格光技术有限公司）。
1.2HaCaT细胞的分离培养和传代：HaCaT细胞系来源于上海中科院细胞研究所，由本实验室冻存传代。用常规方法复苏细胞后，使用含5%小牛血清的改良1640培养基在37°C二氧化碳培养箱常规培养。细胞增殖至铺满80%左右时，使用胰蛋白酶常温下消化数分钟，小牛血清终止消化，常规方法传代。
1.3Kc的分离培养和传代：皮肤来源于正常男子包皮环切术后包皮组织。取全层皮肤用PBS反复漂洗后，除去脂肪和结缔组织。剪碎皮肤移入分离酶中，4°C过夜后分离表皮，热消化，1000rpm离心5min，加入Epilife培养基常规培养。细胞增殖至铺满80%左右时，使用胰蛋白酶冷消化，常规方法传代。
1.4实验分组与实验方法
1.4.1HaCaT细胞MTT实验：接种HaCaT细胞于3块24孔板，细胞密度40000个/孔，每块板均设4个组，A（ALAOmM，红光能量21J/cm2），B（ALA 0.01mM，红光能量21J/cm2），c（ALA0.1mM，红光能量21J/cm2），D（ALA0.5mM，紅光能量21J/cm2）。各组培养24h后，按分组加入ALA避光孵育30min，633nm红光照射，分别于0h、24h、48行MTT测A490值。
1.4.2人角质形成细胞MTT实验：接种角质形成细胞于3块96孔板，细胞密度104个/孔，分组和实验均同HaCaT细胞，最后也分别于0h、2411、48h行MTT测A490值。
1.4.3细胞因子ELISA检测：实验分组同人角质形成细胞MTT实验，每组培养24h，加入ALA避光孵育30min，633nm红光照射后，分别于0h、24h、48h收集细胞培养上清液，再按ELISA试剂盒说明书的方法，分别检测碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（YEW）的浓度。
1.5统计学方法：使用Excel和CurveExpert1.3软件进行曲线制作和分析，SPSSl9.0软件作单因素方差分析（P<0.05）。
2.结果
2.1角质形成细胞形态学观察：倒置显微镜下观察可见，表皮细胞接种24h内贴壁，细胞以圆形为主，随着时间的延长，细胞伸展成椭圆形、不规则形，体积变大。3d左右可见数个角质形成细胞形成的小集落，4周可见卫星样表皮细胞增殖。1周左右细胞汇合连接成片。0.5mM ALA-PDT干预48h后细胞部分脱离贴壁状态；其他浓度剂量的ALA-PDT干预后与单纯红光照射后相比未有明显不同。 2.2ALA-PDT对HaCaT细胞增殖的影响：结果可见，在PDT作用后24h和48h，低剂量AIA（0.1mM和0.01mM）预处理，PDT能促进HaCaT细胞的增殖（B、c组），且二者差异不大（P>0.05）；而当ALA浓度为0.5mM时，ALA-PDT明显抑制细胞增殖（P<0.05）（D组）（图1）。
2.2ALA-PDT对角质形成细胞（Kc）增殖的影响：结果可见，在ALA-PDT作用后24h和48h，低剂量ALA（0.1mM和0.01mM）预处理，PDT均能促进Kc的增殖（B、c组），且二者无明显差异（P>0.05）；而当ALA浓度为0.5mM时，ALAPDT抑制细胞增殖，且48h后抑制作用更明显（P<0.05）（D组）（图2）。
2.3ALA-PDT对角质形成细胞分泌bFGF和VEGF的影响：ELISA检测bFGF结果发现：当ALA-PDT作用后24h时，A、B、c各组bFGF浓度明显高于D组，而低剂量组（A、B组）的bFGF浓度升高最为明显。ELISA检测VEGF结果发现：当光照后24h，各组VEGF轻度下降；48h后，各组VEGF明显升高。
3.讨论
近年来，光动力治疗在皮肤科应用广泛，无论是在癌前病变还是肿瘤性疾病都取得一定的疗效，尤其是在日光性角化病、Bowen’s病、增殖性红斑、基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌等疾病中得到了较好的效果。同时，光动力治疗在一些非肿瘤性疾病如痤疮、尖锐湿疣等也疗效显著，能明显降低复发率。综合来看，光动力治疗大部分都应用在杀灭细菌和杀死肿瘤细胞的方面，其基本原理主要在于：①当光敏剂被组织摄取，暴露于适当波长的光，將从基态激活到激发态。激活的光敏剂可以形成自由基，然后与氧气产生活性氧（ROS）（I型反应）；也可以形成单线态氧（O2）（II型反应）；ROS与O2的氧化作用可以杀伤细胞和微生物，而光敏剂聚集越多的地方则杀伤作用愈强；②PDT可以激活多种免疫细胞和炎性细胞因子，产生杀伤作用。
目前，大部分的研究和应用都基于高剂量的光敏剂和高能量的光照，通过其杀伤作用达到治疗目的。但是最近的一些研究表明，低剂量光动力治疗其实有不同的效果，其有抑制炎症，治疗光老化等作用。本文的研究旨在探讨低剂量PDT对角质形成细胞的影响。结果发现，21J/cm2光照条件下，0.5mM ALA预处理与0.1mM和0.01mM ALA预处理后的结果有显著差异，0.5mM ALA-PDT组抑制角质形成细胞的增殖，而低剂量（0.1mM和O.01raM）ALA-PDT有不同程度的促进作用。
我们进一步用ELISA检测ALA-PDT对体外培养人角质形成细胞分泌bFGF和VEGF的影响。结果发现：①低剂量ALAPDT作用后24h和48h，人角质形成细胞分泌的bFGF高于高剂量组和单纯红光组；②ALA-PDT干预后，24h时，人角质形成细胞分泌VEGF的变化较小，48h时，各组的VEGF的含量明显上升，0.1mM和0.5mM组上升更明显。既往的研究中，Stachon等人。證明了以二氢卟吩E6为光敏剂，637nm红光（24J/cm2）照射人角膜细胞24h之后，VEGF有上升的趋势，但他们没有进一步研究干预48h后的变化。也有研究者发现PDT通过激活c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶通路和p38有丝分裂原激活蛋白酶通路诱导VEGF的表达。于是，我们推测低剂量PDT产生的低浓度的ROS，诱导了生物调节作用，也许能通过某些信号途径（如有丝分裂原激活蛋白酶通路）促进bFGF和VEGF的分泌，但是，两种生长因子的分泌规律并不与细胞增殖完全相同，提示还有其他因素起了重要作用，其中的具体机制和涉及的信号通路有待进一步实验阐明。
综上所述，本研究发现高剂量ALA-PDT抑制角质形成细胞的增殖，低剂量ALA-PDT则有利于其增殖，并且能促进其分泌bFGF和VEGF，但其规律和具体机制有待探讨。继续深入探索低剂量ALA-PDT作用的具体机制很有必要，对明确PDT这种全新治疗方法在不同条件下的不同生物学效应，并全面了解其作用原理有着重要的意义，更为拓展PDT的适应症奠定理论和实验基础。