论文部分内容阅读
摘要 [目的]研究软骨发育与重建，建立软骨体外培养模式，[方法]通过改良组织块细胞培养法，进行家兔耳廓弹性软骨细胞的体外培养，研究其形态与生长特性。[结果]兔耳软骨组织16 h完成贴壁，1.5 d软骨细胞迁出，144 h细胞生长达到融合；传代兔耳软骨细胞12 h贴壁，生长特性与原代相似，但第3代细胞的延滞期长，在培养48 h开始进入对数期，培养第8天细胞数量达到峰值。HE染色结果表明弹性软骨细胞形态均匀，细胞呈圆形或椭圆形，核呈椭圆形，可见双核或多核现象。软骨陷窝和核深染，胞浆着色均匀。细胞分裂旺盛。同族细胞群清晰。[结论]原代及2代耳软骨细胞体外生长特性及细胞形态一致，培养条件稳定。
关键词 弹性软骨；改良组织块法；体外培养；细胞特性
中图分类号 S829.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02323-03
Culture in vitro of Rabbit Auricular Cartilage and Its Cell Characteristics
XIE Bo， GAO Qinghua， WANG Shanshan，et al （College of Animal Science， Tarim University， Alar， Xinjiang 843300； College of Life Sciences， Tarim University， Alar， Xinjiang 843300）
Abstract [Objective] The research aimed to study the development and reconstruction of cartilage and establish in vitro cultivation mode of cartilage. [Method] The elastic cartilage cells of rabbit auricle were cultured in vitro by using modified tissue block cell culture method. And their morphological and growth characteristics were studied. [Result] The cartilage tissue of rabbit auricle adhered to wall within 16 h and cartilage cells fell off after 1.5 d， the cells grew and fused after 144 h. The generated cartilage cells of rabbit auricle adhered to wall within 12 h and their growth characteristics were similar with the primary generation. The third generation of cells had a long lag phase， entered into the logarithmic phase after culturing 48 h and the cell number reached the peak value on the eighth day. HE staining results showed that the configuration of elastic cartilage cells was uniformed， the cells were round or oval and their cores were elliptical. Dual-core or multi-core phenomena were seen. The cartilage lacuna and nuclear were stained， and the staining of cytoplasm was uniformed. Cell division was very vigorous. The same family of cell populations was clearly seen. [Conclusion] The primary and two generations of rabbit auricle cartilage cells had consistent growth characteristics and cell morphology and stable culture conditions.
Key words Elastic cartilage； Modified tissue block； Culture in vitro； Cell characteristics
彈性软骨仅存在高等动物外耳廓、听道、会咽等处。与其他软骨相比，间质中含有大量交织成网的弹性纤维，成网状在软骨内排列，同时含少量胶原纤维。目前，弹性软骨大多被用于修复人类残缺及畸形耳廓及其他美容修复[1]。另外，还被用于透明软骨的修复。MATEV GORENEK等[2]以兔耳软骨为材料，成功体外培养后移植到兔腰椎间盘，研究自体软骨移植方式对人类腰椎间盘进行性退化的治疗效果，结果发现用耳弹性软骨移植至6周后在髓核处有类透明软骨组织产生，而在腰椎间盘处的软骨基质中未发现弹性软骨的细胞。Mizuno M等[3]用同样的方法用将狗的耳弹性软骨移植到其受伤的膝关节处，结果发现移植的弹性软骨细胞能够重塑透明软骨，为人类关节进行性退化疾病找到很好的解决方法。由此可见，弹性软骨对关节透明软骨的重建和修复有重要意义。 目前我国对弹性软骨的体外培养开始于2000年。张金宁等体外培养了猕猴耳软骨，并分析了体外环境下软骨细胞的代谢功能。温叶飞[4]、常庆[5]、蒋欣泉[6]和谢波[7]分别利用猪、羊和兔的耳廓软骨进行体外培养。冉鹏[8]对人耳廓软骨进行了体外培养，认为体外培养的人耳软骨细胞生物学特性不依赖年龄，体外培养的第1代和第2代人耳软骨细胞可作为耳软骨组织工程研究的种子细胞。
基于此，笔者利用兔耳廓软骨作为材料，通过体外培养观察弹性软骨细胞在离体情况下的生长状态及特性，确定生长条件，以期为弹性软骨体外工程组织研究提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 2月龄健康雌性家兔。
1.2 试剂与仪器 胎牛血清FBS（Sigma）；细胞培养液LDMEM；透明质酸酶（Sigma）；Ⅱ型胶原酶（Sigma）；胰蛋白酶（Sigma）；噻唑蓝MTT；青霉素钠；硫酸链霉素；CO2加湿培养箱（MCO15A）；倒置相差显微镜（Nikon）；离心机（Sigma）；生物显微镜（舜宇）；酶标仪（Biotek）；血细胞计数器；无菌操作台。
1.3 方法
1.3.1 取样与处理。耳缘静脉注射盐酸普鲁卡因，麻醉家兔，剪掉兔耳边缘的兔毛，用5%碘酊的消毒，酒精棉脱碘，随后使用灭菌手术剪快速剪取1 cm×1 cm大小的兔耳组织，立即置于1 000 IU/ml的双抗（青霉素钠与硫酸链霉素）DHanks液中浸泡5 min。转入超净台内操作，修剪皮肤边缘，用含400 IU/ml的双抗DHanks冲洗3～5遍，在200 IU/ml双抗的DHanks液中使用无菌眼科镊将软骨与表皮充分剥离。
1.3.2 原代培养。处理后软骨组织剪碎为1 mm×1 mm×1 mm的组织块后，转移至15 ml的离心管，加入DHanks液反复吹打，漂洗2～3次，用DMEM工作液配制的0.1%透明质酸酶在培养箱中37 ℃消化30 min，弃去透明质酸酶，加入DHanks配制的0.25%的胰蛋白酶37 ℃下消化1 h，离心弃胰蛋白酶用DHanks漂洗，加入用含5%血清的DMEM配制的Ⅱ型胶原酶，37 ℃下消化6 h，移除上清液，加入5 ml的DHanks液反复吹打，漂洗2～3次，移除上清，将组织块均匀的分布于培养瓶底部，然后将培养瓶底部倾斜，沿斜面加入5 ml 15% 胎牛血清（FBS）100 IU/ml双抗的DMEM培养液，底面向上倒置放入38.5 ℃、5% CO2加湿培养箱中，待组织块贴壁后轻轻反转培养瓶，在38.5 ℃、5% CO2加湿培养箱中继续培养。此后，根据细胞生长状况，每隔48～72 h换液1次，直至组织块边缘游离出的细胞已经完全包围组织块，将培养瓶内的组织块取出，在新的灭菌培养瓶内按照相同的方法继续培养组织块。每日观察并记录软骨细胞的形态、数目、生长、分裂和增殖等状况。
1.3.3 细胞传代培养。生长融合的细胞可进行传代，用DHanks液清洗贴壁细胞3次，从培养瓶侧面缓缓加入0.25%胰蛋白酶消化3～5 min，待细胞变圆变亮、将脱壁时，加入完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，将收集消化下的细胞置于10 ml离心管内，800 r/min离心5 min。弃上清，调整密度，以1×105个/ml接种到含15%FBS的DMEM培养液中，吸管吹打混匀，以5 ml的接种量接入培养瓶，放入培养箱中培养。24 h以后完全换液，除去未贴壁细胞，以后每72 h半量换液。
1.3.4 细胞形态观察。在倒置显微镜下观察不同代数、不同时期细胞的形态。取原代细胞爬片HE染色，显微镜下观察细胞形态。
1.3.5 生长曲线的绘制。10%FBS的DMEM培养液吹打“1.2.2”中离心到的细胞，制成细胞悬浮液，用台盼蓝染色调整细胞浓度到1×105个/ml，以100 μl的接种量接入96孔培养板的孔内，同时设立不含细胞的培养基做空白对照孔，次日在每个孔内补液100 μl；24 h以后每天随机抽取3个孔，每个孔分别加入20 μl MTT溶液，此后继续培养4 h，再将孔内液体吸出弃掉，再加入80 μl DMSO，吹打至沉淀完全溶解后，使用酶联免疫检测仪于波长490 nm处测定吸光度，计算平均值。以时间为横坐标，以平均吸光度为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
2 结果与分析
2.1 原代培养 从图1可以看出，处理组织块24 h后完全贴壁，贴壁的组织块边缘模糊不清。贴壁后的组织块原代培养24 h倒置显微镜下观察，发现组织块边缘迁出少量的软骨细胞，细胞呈梭形，细胞核不可见，细胞轮廓清晰。贴壁后培养72 h后，大量的软骨细胞从组织块中迁出，呈规律的放射状排列，细胞呈梭形，细胞的透过性增强。此后细胞不断增殖，在组织块贴壁120 h后细胞数量达到高峰，细胞排列紧密，呈菊花瓣状排列开，细胞核呈圆形或椭圆形，且细胞遮光性增强。
2.2 细胞爬片HE染色 从图2可以看出，HE染色的弹性软骨细胞形态均匀，细胞呈圆形或椭圆形，核呈椭圆形，可见双核或多核现象。软骨陷窝和核深染，胞浆着色均匀。细胞分裂旺盛。同族细胞群清晰可见。
2.3 生长曲线 从图3可以看出，体外培养耳弹性软骨细胞，原代细胞与1代细胞均在培养144 h细胞数量达到峰值。第3代细胞的延滞期长，在培养48 h开始进入对数期，培养到192 h（第8天）细胞数量达到峰值。
3 讨论
原代细胞及第1代细胞的生长曲线一致，细胞生长能力旺盛。该试验结果与温叶飞[4]用猪耳软骨为材料体外培养的结果相一致，而与猕猴耳软骨细胞的生长特性有所差异，细胞倍增时间比猕猴耳软骨细胞早24 h。兔耳第3代细胞的生长能力开始下降。潜伏期增长这一结果与猪耳软骨细胞不同，猪耳软骨的第6代细胞生长开始变慢。细胞体外条
件下生長受多个因素（如温度、渗透压、有害物质或细菌污染等）的影响。笔者在第4代细胞中发现有严重的霉菌污染，因此推断第3代细胞已开始有霉菌的轻度污染，从而影响了第3代细胞的生长。
参考文献
[1] TERADA S，FUCHS J R，YOSHIMOTO H，et al.In vitro cartilage regeneration from proliferated adult elastic chondrocytes[J].Ann Plast Surg，2005，55（2）：196-201.
[2] GORENSEK M，JAKSIMOVIC C，KREGAR-VELIKONJA N，et al.Nucleus pulposus repair with cultured autologous elastic cartilage derived chondrocytes[J].Cell Mol Biol Lett，2004，9（2）：363-373.
[3] MIZUNO M，KOBAYASHI S，TAKEBE T，et al.Reconstruction of joint hyaline cartilage by autologous progenitor cells derived from ear elastic cartilage[J].Stem Cells，2014，32（3）：816-821.
[4] 温叶飞.耳廓软骨细胞生物学特性研究及组织工程软骨的体外构建初探[D].杨凌：西北农林科技大学，2004.
[5] 常庆，张秀丽，蒋欣泉.AdLacZ基因修饰山羊耳软骨细胞复合F127构建组织工程化软骨[J].中国组织工程研究与临床康复，2007（32）：6326-6329.
[6] 蒋欣泉，常庆，张秀丽，等.骨形成蛋白2基因修饰的山羊耳软骨细胞体内异位植入研究[J].中国口腔颌面外科杂志，2008（1）：38-42.
[7] 谢波，丁文峰，平亦雯，等.改良组织块法培养原代兔耳软骨细胞[J].塔里木大学学报，2013（2）：48-52.
[8] 冉鹏.人耳软骨细胞体外培养的实验研究[D].上海：复旦大学，2005.
关键词 弹性软骨；改良组织块法；体外培养；细胞特性
中图分类号 S829.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02323-03
Culture in vitro of Rabbit Auricular Cartilage and Its Cell Characteristics
XIE Bo， GAO Qinghua， WANG Shanshan，et al （College of Animal Science， Tarim University， Alar， Xinjiang 843300； College of Life Sciences， Tarim University， Alar， Xinjiang 843300）
Abstract [Objective] The research aimed to study the development and reconstruction of cartilage and establish in vitro cultivation mode of cartilage. [Method] The elastic cartilage cells of rabbit auricle were cultured in vitro by using modified tissue block cell culture method. And their morphological and growth characteristics were studied. [Result] The cartilage tissue of rabbit auricle adhered to wall within 16 h and cartilage cells fell off after 1.5 d， the cells grew and fused after 144 h. The generated cartilage cells of rabbit auricle adhered to wall within 12 h and their growth characteristics were similar with the primary generation. The third generation of cells had a long lag phase， entered into the logarithmic phase after culturing 48 h and the cell number reached the peak value on the eighth day. HE staining results showed that the configuration of elastic cartilage cells was uniformed， the cells were round or oval and their cores were elliptical. Dual-core or multi-core phenomena were seen. The cartilage lacuna and nuclear were stained， and the staining of cytoplasm was uniformed. Cell division was very vigorous. The same family of cell populations was clearly seen. [Conclusion] The primary and two generations of rabbit auricle cartilage cells had consistent growth characteristics and cell morphology and stable culture conditions.
Key words Elastic cartilage； Modified tissue block； Culture in vitro； Cell characteristics
彈性软骨仅存在高等动物外耳廓、听道、会咽等处。与其他软骨相比，间质中含有大量交织成网的弹性纤维，成网状在软骨内排列，同时含少量胶原纤维。目前，弹性软骨大多被用于修复人类残缺及畸形耳廓及其他美容修复[1]。另外，还被用于透明软骨的修复。MATEV GORENEK等[2]以兔耳软骨为材料，成功体外培养后移植到兔腰椎间盘，研究自体软骨移植方式对人类腰椎间盘进行性退化的治疗效果，结果发现用耳弹性软骨移植至6周后在髓核处有类透明软骨组织产生，而在腰椎间盘处的软骨基质中未发现弹性软骨的细胞。Mizuno M等[3]用同样的方法用将狗的耳弹性软骨移植到其受伤的膝关节处，结果发现移植的弹性软骨细胞能够重塑透明软骨，为人类关节进行性退化疾病找到很好的解决方法。由此可见，弹性软骨对关节透明软骨的重建和修复有重要意义。 目前我国对弹性软骨的体外培养开始于2000年。张金宁等体外培养了猕猴耳软骨，并分析了体外环境下软骨细胞的代谢功能。温叶飞[4]、常庆[5]、蒋欣泉[6]和谢波[7]分别利用猪、羊和兔的耳廓软骨进行体外培养。冉鹏[8]对人耳廓软骨进行了体外培养，认为体外培养的人耳软骨细胞生物学特性不依赖年龄，体外培养的第1代和第2代人耳软骨细胞可作为耳软骨组织工程研究的种子细胞。
基于此，笔者利用兔耳廓软骨作为材料，通过体外培养观察弹性软骨细胞在离体情况下的生长状态及特性，确定生长条件，以期为弹性软骨体外工程组织研究提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 2月龄健康雌性家兔。
1.2 试剂与仪器 胎牛血清FBS（Sigma）；细胞培养液LDMEM；透明质酸酶（Sigma）；Ⅱ型胶原酶（Sigma）；胰蛋白酶（Sigma）；噻唑蓝MTT；青霉素钠；硫酸链霉素；CO2加湿培养箱（MCO15A）；倒置相差显微镜（Nikon）；离心机（Sigma）；生物显微镜（舜宇）；酶标仪（Biotek）；血细胞计数器；无菌操作台。
1.3 方法
1.3.1 取样与处理。耳缘静脉注射盐酸普鲁卡因，麻醉家兔，剪掉兔耳边缘的兔毛，用5%碘酊的消毒，酒精棉脱碘，随后使用灭菌手术剪快速剪取1 cm×1 cm大小的兔耳组织，立即置于1 000 IU/ml的双抗（青霉素钠与硫酸链霉素）DHanks液中浸泡5 min。转入超净台内操作，修剪皮肤边缘，用含400 IU/ml的双抗DHanks冲洗3～5遍，在200 IU/ml双抗的DHanks液中使用无菌眼科镊将软骨与表皮充分剥离。
1.3.2 原代培养。处理后软骨组织剪碎为1 mm×1 mm×1 mm的组织块后，转移至15 ml的离心管，加入DHanks液反复吹打，漂洗2～3次，用DMEM工作液配制的0.1%透明质酸酶在培养箱中37 ℃消化30 min，弃去透明质酸酶，加入DHanks配制的0.25%的胰蛋白酶37 ℃下消化1 h，离心弃胰蛋白酶用DHanks漂洗，加入用含5%血清的DMEM配制的Ⅱ型胶原酶，37 ℃下消化6 h，移除上清液，加入5 ml的DHanks液反复吹打，漂洗2～3次，移除上清，将组织块均匀的分布于培养瓶底部，然后将培养瓶底部倾斜，沿斜面加入5 ml 15% 胎牛血清（FBS）100 IU/ml双抗的DMEM培养液，底面向上倒置放入38.5 ℃、5% CO2加湿培养箱中，待组织块贴壁后轻轻反转培养瓶，在38.5 ℃、5% CO2加湿培养箱中继续培养。此后，根据细胞生长状况，每隔48～72 h换液1次，直至组织块边缘游离出的细胞已经完全包围组织块，将培养瓶内的组织块取出，在新的灭菌培养瓶内按照相同的方法继续培养组织块。每日观察并记录软骨细胞的形态、数目、生长、分裂和增殖等状况。
1.3.3 细胞传代培养。生长融合的细胞可进行传代，用DHanks液清洗贴壁细胞3次，从培养瓶侧面缓缓加入0.25%胰蛋白酶消化3～5 min，待细胞变圆变亮、将脱壁时，加入完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，将收集消化下的细胞置于10 ml离心管内，800 r/min离心5 min。弃上清，调整密度，以1×105个/ml接种到含15%FBS的DMEM培养液中，吸管吹打混匀，以5 ml的接种量接入培养瓶，放入培养箱中培养。24 h以后完全换液，除去未贴壁细胞，以后每72 h半量换液。
1.3.4 细胞形态观察。在倒置显微镜下观察不同代数、不同时期细胞的形态。取原代细胞爬片HE染色，显微镜下观察细胞形态。
1.3.5 生长曲线的绘制。10%FBS的DMEM培养液吹打“1.2.2”中离心到的细胞，制成细胞悬浮液，用台盼蓝染色调整细胞浓度到1×105个/ml，以100 μl的接种量接入96孔培养板的孔内，同时设立不含细胞的培养基做空白对照孔，次日在每个孔内补液100 μl；24 h以后每天随机抽取3个孔，每个孔分别加入20 μl MTT溶液，此后继续培养4 h，再将孔内液体吸出弃掉，再加入80 μl DMSO，吹打至沉淀完全溶解后，使用酶联免疫检测仪于波长490 nm处测定吸光度，计算平均值。以时间为横坐标，以平均吸光度为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
2 结果与分析
2.1 原代培养 从图1可以看出，处理组织块24 h后完全贴壁，贴壁的组织块边缘模糊不清。贴壁后的组织块原代培养24 h倒置显微镜下观察，发现组织块边缘迁出少量的软骨细胞，细胞呈梭形，细胞核不可见，细胞轮廓清晰。贴壁后培养72 h后，大量的软骨细胞从组织块中迁出，呈规律的放射状排列，细胞呈梭形，细胞的透过性增强。此后细胞不断增殖，在组织块贴壁120 h后细胞数量达到高峰，细胞排列紧密，呈菊花瓣状排列开，细胞核呈圆形或椭圆形，且细胞遮光性增强。
2.2 细胞爬片HE染色 从图2可以看出，HE染色的弹性软骨细胞形态均匀，细胞呈圆形或椭圆形，核呈椭圆形，可见双核或多核现象。软骨陷窝和核深染，胞浆着色均匀。细胞分裂旺盛。同族细胞群清晰可见。
2.3 生长曲线 从图3可以看出，体外培养耳弹性软骨细胞，原代细胞与1代细胞均在培养144 h细胞数量达到峰值。第3代细胞的延滞期长，在培养48 h开始进入对数期，培养到192 h（第8天）细胞数量达到峰值。
3 讨论
原代细胞及第1代细胞的生长曲线一致，细胞生长能力旺盛。该试验结果与温叶飞[4]用猪耳软骨为材料体外培养的结果相一致，而与猕猴耳软骨细胞的生长特性有所差异，细胞倍增时间比猕猴耳软骨细胞早24 h。兔耳第3代细胞的生长能力开始下降。潜伏期增长这一结果与猪耳软骨细胞不同，猪耳软骨的第6代细胞生长开始变慢。细胞体外条
件下生長受多个因素（如温度、渗透压、有害物质或细菌污染等）的影响。笔者在第4代细胞中发现有严重的霉菌污染，因此推断第3代细胞已开始有霉菌的轻度污染，从而影响了第3代细胞的生长。
参考文献
[1] TERADA S，FUCHS J R，YOSHIMOTO H，et al.In vitro cartilage regeneration from proliferated adult elastic chondrocytes[J].Ann Plast Surg，2005，55（2）：196-201.
[2] GORENSEK M，JAKSIMOVIC C，KREGAR-VELIKONJA N，et al.Nucleus pulposus repair with cultured autologous elastic cartilage derived chondrocytes[J].Cell Mol Biol Lett，2004，9（2）：363-373.
[3] MIZUNO M，KOBAYASHI S，TAKEBE T，et al.Reconstruction of joint hyaline cartilage by autologous progenitor cells derived from ear elastic cartilage[J].Stem Cells，2014，32（3）：816-821.
[4] 温叶飞.耳廓软骨细胞生物学特性研究及组织工程软骨的体外构建初探[D].杨凌：西北农林科技大学，2004.
[5] 常庆，张秀丽，蒋欣泉.AdLacZ基因修饰山羊耳软骨细胞复合F127构建组织工程化软骨[J].中国组织工程研究与临床康复，2007（32）：6326-6329.
[6] 蒋欣泉，常庆，张秀丽，等.骨形成蛋白2基因修饰的山羊耳软骨细胞体内异位植入研究[J].中国口腔颌面外科杂志，2008（1）：38-42.
[7] 谢波，丁文峰，平亦雯，等.改良组织块法培养原代兔耳软骨细胞[J].塔里木大学学报，2013（2）：48-52.
[8] 冉鹏.人耳软骨细胞体外培养的实验研究[D].上海：复旦大学，2005.