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摘要：草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是新传入我国的重要害虫。本研究利用mtCOI基因作为分子标记，对传入山东省9个地市17个县（市、区）的49个草地贪夜蛾样本进行分子鉴定。结果表明，山东地区共发现两个mtCOI单倍型，系统发育分析表明分别隶属于玉米型与水稻型，其中传入济宁梁山的为玉米型（占6.1%），其余地区均为水稻型（93.9%）。本研究明确了传入山东省的草地贪夜蛾单倍型及其分布，对该虫的预警与防控具有参考价值。
关键词：草地贪夜蛾;mtCOI;水稻型;玉米型;山东省
中图分类号：S433.4 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2020）02-0097-04
Abstract As an important pest introduced into China this year， Spodoptera frugiperda has been discovered in Shandong Province leading to a serious threat to the food security. In this study， the mitochondrial COI gene was used as a molecular marker to identify 49 S. frugiperda samples from 17 districts of 9 cities in Shandong Province. The results showed that two mtCOI haplotypes were identified， and the individuals from Liangshan of Jining City belonged to corn strain （6.1%） while the rest belonged to rice strain （93.9%）. In this study， the haplotypes of S. frugiperda and their distribution in Shandong Province were clarified， which had important guiding significance for the future risk assessment and management of this pest.
Keywords Spodoptera frugiperda; mtCOI; Corn strain; Rice strain; Shandong Province
草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（Smith），又称秋粘虫，属鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）。该虫原产于美洲热带和亚热带地区，具有杂食性、迁飞性、暴发性以及繁殖力强等特点，近年来逐渐成为一种世界范围的重大入侵农业害虫[1]。该虫自今年传入我国以来，已在至少22省1 280个县（市、区）为害，发生面积超过80万公顷[2]。山东省于2019年6月20日在临沂市郯城首次通过诱捕器发现一只雄虫，7月16日在滕州市首先发现幼虫为害。目前，山东半岛、鲁南和鲁西南地区均发现该虫为害。
草地贪夜蛾具有极广的食物谱，能危害80多种作物，特别是能导致玉米、水稻、高粱、牧草等禾本科作物严重减产[3]。该虫分为水稻型（rice strain）和玉米型（corn strain），两者在表型上几乎无法区分，性信息素组分也相同，甚至可以杂交产生可育后代[4]。但在寄主植物种类的偏好性、交配行为以及性信息素组分的比例等方面存在一定差异[5-7]。对草地贪夜蛾进行分子鉴定、明确传入山东的草地贪夜蛾亚型，有助于了解该害虫传入途径，可为其生物学特性研究奠定基础，对该害虫的防控具有重要意义。
目前，线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因（mtCOI）[8-10]以及位于核基因组Z染色体上的磷酸甘油醛异构酶基因（Tpi）[11，12]被作为草地贪夜蛾鉴定以及区分不同亚型的主要分子标记。通过两种标记基因的鉴定，发现入侵我国的草地贪夜蛾种群线粒体基因组绝大多数为水稻型，而基于核基因组Tpi基因分析则全部为玉米型[13，14]。目前，入侵山东地区草地贪夜蛾的亚型和种群遗传特征尚不明确。
本研究利用mtCOI基因，对采集自山东境内49个草地贪夜蛾样品进行分子鉴定，以期进一步明确虫源信息及其发生特征和暴发规律，并为指导山东草地贪夜蛾的监测预警和早期控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为山东省各地初期发现的草地贪夜蛾疑似样本，共49个个体，均为4～6龄期幼虫。采集地点包括青岛、烟台、威海、日照、临沂、济宁、菏泽、聊城、枣庄等地市下属的17个县（市、区）。寄主均為苗期至抽雄初期的玉米，每地点样品数1～6个。样品采集后，活体常温运送至实验室进行下一步的鉴定和检测工作。
1.2 DNA提取及PCR扩增
样品DNA提取采用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒。单头虫体用液氮研磨后，按照说明书进行提取，后利用纯化的DNA作为模板，对mtCOI基因片段进行PCR扩增。引物序列参照Nagoshi等[11]的设计，上游引物：5′-TTCGAGCTGAATTAGGGACT-3′，下游引物：5′-GATGTAAAATATGCTCGTGT-3′。PCR反应体系（13 μL）：DNA 模板1.5 μL，buffer 1.3 μL，上下游引物各0.26 μL，dNTP 0.26 μL，Taq酶0.13 μL，ddH2O 9.3 μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，34个循环;72℃延伸10 min。PCR扩增结束后，使用1%琼脂糖电泳检测扩增结果，选取与目标片段长度一致的单一片段PCR产物切胶、回收并送擎科生物股份有限公司测序。 1.3 数据分析
从GenBank数据库中下载部分已发布的草地贪夜蛾（已确认的玉米型和水稻型）对应基因序列，以棉铃虫mtCOI序列作为外群构建系统进化树。选取Kimura-2参数模型，依据邻接法（NJ）构建系统进化树，系统树各分支的自举检验值（bootstrap）1 000次重复检验。
2 结果与分析
2.1 草地贪夜蛾mtCOI单倍型判断与系统发育分析
将山东各地区样本的mtCOI基因序列进行比对分析，发现山东省的mtCOI基因仅有两个单倍型，分别命名为山东单倍型1和山东单倍型2。系统发育分析（图1）发现，山东单倍型1的mtCOI序列与来自中国广东、印度、巴西、南非、美国的水稻型序列聚在一起，应属于水稻型;山东单倍型2的序列与美国、中国广东、墨西哥玉米型序列聚在一起，应属于玉米型。
2.2 草地贪夜蛾mtCOI单倍型的分布
山东地区采集的49个个体中，山东单倍型1共46个，占93.9%，分布于青岛市城阳、即墨、胶州、平度和枣庄市滕州、日照市岚山、日照市五莲、临沂市临沭、临沂市郯城、烟台市海阳、威海市乳山、威海市荣成、烟台市牟平、聊城市东昌府、菏泽市东明和菏泽市鄄城共16个县（市、区）;山东单倍型2共3个个体，占6.1%，均出自济宁市梁山（表1，图2）。
3 讨论与结论
本研究以mtCOI作为分子标记，对首次入侵山东各地的草地贪夜蛾样本进行了分子鉴定，结果发现两个mtCOI单倍型，分别属于玉米型和水稻型，其中属于水稻型的单倍型样本占绝大多数，因此，入侵山东省的草地贪夜蛾并非单一来源。张磊等[14]研究发现，侵入中国地区的草地贪夜蛾的线粒体基因组以水稻型为主，玉米型仅占极少数。本试验结果与其基本一致。
草地贪夜蛾的不同亚型直接决定对寄主植物的取食偏好性。目前入侵的草地贪夜蛾以为害玉米为主，但也陆续发现其在小麦、花生、水稻和大豆等作物上的为害证据[15-17]。本研究通过分子鉴定，明确入侵山东草地贪夜蛾的线粒体单倍型构成，为进一步探究草地贪夜蛾寄主选择和种群遗传学信息的关系奠定了基础，对今后草地贪夜蛾的风险评估、精准监测预警和绿色防控具有重要指导意义。
参 考 文 献：
[1] 赵胜园，罗倩明，孙小旭，等. 草地贪夜蛾与斜纹夜蛾的形态特征和生物学习性比较[J]. 中国植保导刊，2019， 39（5）：26-35.
[2] 姜玉英，刘杰，朱晓明. 草地贪夜蛾侵入我国的发生动态和未来趋势分析[J]. 中国植保导刊，2019， 39（2）： 33-35.
[3] 郭井菲，静大鹏，太红坤，等. 草地贪夜蛾形态特征及与3种玉米田为害特征和形态相近鳞翅目昆虫的比较[J]. 植物保护，2019， 45（2）：7-12.
[4] 江南纪，王琛柱. 草地贪夜蛾的性信息素通讯研究进展[J]. 昆虫学报，2019， 62 （8）：993-1002.
[5] 陈冬平，陈志廷，徐汉虹，等. 不同分子标记对入侵广州草地贪夜蛾的寄主型鉴别能力比较[J/OL]. 华南农业大学学报， 2019. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20190617.1027.002.html.
[6] 王磊，陈科伟，钟国华，等. 重大入侵害虫草地贪夜蛾发生危害、防控研究进展及防控策略探讨[J]. 环境昆虫学报，2019， 41（3）：479-487.
[7] Groot A T， Marr M， Schfl G， et al. Host strain specific sex pheromone variation in Spodoptera frugiperda[J]. Frontiers in Zoology， 2008， 5： 20.
[8] 叶昕海，杨义，梅洋，等. 草地贪夜蛾基因组注释及分析[J]. 环境昆虫学报，2019， 41（4）：706-717.
[9] Jacobs A， Van V A， Rong I H. Characterisation of the fall armyworm （Spodoptera frugiperda J. E. Smith） （Lepidoptera： Noctuidae） from South Africa[J]. Africa Entomology， 2018， 26（1）： 45-49.
[10] Nagoshi R N， Meagher R L， Adamczyk J J J， et al. New restriction fragment length polymorphisms in the cytochrome oxidase i gene facilitate host strain identification of fall armyworm （Lepidoptera： Noctuidae） populations in the southeastern United States[J]. Journal of Economic Entomology， 2006， 99（3）： 671-677.
[11] Nagoshi R N， Koffi D， Agboka K， et al. Comparative molecular analyses of invasive fall armyworm in Togo reveal strong similarities to populations from the eastern United States and the greater antilles[J]. PLoS ONE， 2017， 12（7）： e0181982.
[12] Prowell D P， Mcmichael M， Silvain J F. Multilocus genetic analysis of host use， introgression， and speciation in host strains of fall armyworm （Lepidoptera： Noctuidae） [J]. Annals of the Entomological Society of America， 2004， 97（5）： 1034-1044.
[13] 徐麗娜，胡本进，苏贤岩，等. 入侵安徽省草地贪夜蛾的遗传分析[J]. 植物保护， 2019， 45（5）：47-53.
[14] 张磊，柳贝，姜玉英，等. 中国不同地区草地贪夜蛾种群生物型分子特征分析[J]. 植物保护，2019， 45（4）：20-27.
[15] 何丽梅，赵胜园，吴孔明. 草地贪夜蛾取食为害花生的研究[J/OL]. 植物保护，2019. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1982.S.20191031.1503.001.html.
[16] 王芹芹，崔丽，王立，等. 草地贪夜蛾对小麦的为害风险：取食为害性及解毒酶活性变化初探[J/OL]. 植物保护，2019. https：//doi.org/10.16688/j.zwbh.2019508.
[17] 杨现明，孙小旭，赵胜园，等. 小麦田草地贪夜蛾的发生为害、空间分布与抽样技术[J/OL].植物保护，2019. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1982.S.20191106.0933.001.html.
关键词：草地贪夜蛾;mtCOI;水稻型;玉米型;山东省
中图分类号：S433.4 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2020）02-0097-04
Abstract As an important pest introduced into China this year， Spodoptera frugiperda has been discovered in Shandong Province leading to a serious threat to the food security. In this study， the mitochondrial COI gene was used as a molecular marker to identify 49 S. frugiperda samples from 17 districts of 9 cities in Shandong Province. The results showed that two mtCOI haplotypes were identified， and the individuals from Liangshan of Jining City belonged to corn strain （6.1%） while the rest belonged to rice strain （93.9%）. In this study， the haplotypes of S. frugiperda and their distribution in Shandong Province were clarified， which had important guiding significance for the future risk assessment and management of this pest.
Keywords Spodoptera frugiperda; mtCOI; Corn strain; Rice strain; Shandong Province
草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（Smith），又称秋粘虫，属鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）。该虫原产于美洲热带和亚热带地区，具有杂食性、迁飞性、暴发性以及繁殖力强等特点，近年来逐渐成为一种世界范围的重大入侵农业害虫[1]。该虫自今年传入我国以来，已在至少22省1 280个县（市、区）为害，发生面积超过80万公顷[2]。山东省于2019年6月20日在临沂市郯城首次通过诱捕器发现一只雄虫，7月16日在滕州市首先发现幼虫为害。目前，山东半岛、鲁南和鲁西南地区均发现该虫为害。
草地贪夜蛾具有极广的食物谱，能危害80多种作物，特别是能导致玉米、水稻、高粱、牧草等禾本科作物严重减产[3]。该虫分为水稻型（rice strain）和玉米型（corn strain），两者在表型上几乎无法区分，性信息素组分也相同，甚至可以杂交产生可育后代[4]。但在寄主植物种类的偏好性、交配行为以及性信息素组分的比例等方面存在一定差异[5-7]。对草地贪夜蛾进行分子鉴定、明确传入山东的草地贪夜蛾亚型，有助于了解该害虫传入途径，可为其生物学特性研究奠定基础，对该害虫的防控具有重要意义。
目前，线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因（mtCOI）[8-10]以及位于核基因组Z染色体上的磷酸甘油醛异构酶基因（Tpi）[11，12]被作为草地贪夜蛾鉴定以及区分不同亚型的主要分子标记。通过两种标记基因的鉴定，发现入侵我国的草地贪夜蛾种群线粒体基因组绝大多数为水稻型，而基于核基因组Tpi基因分析则全部为玉米型[13，14]。目前，入侵山东地区草地贪夜蛾的亚型和种群遗传特征尚不明确。
本研究利用mtCOI基因，对采集自山东境内49个草地贪夜蛾样品进行分子鉴定，以期进一步明确虫源信息及其发生特征和暴发规律，并为指导山东草地贪夜蛾的监测预警和早期控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为山东省各地初期发现的草地贪夜蛾疑似样本，共49个个体，均为4～6龄期幼虫。采集地点包括青岛、烟台、威海、日照、临沂、济宁、菏泽、聊城、枣庄等地市下属的17个县（市、区）。寄主均為苗期至抽雄初期的玉米，每地点样品数1～6个。样品采集后，活体常温运送至实验室进行下一步的鉴定和检测工作。
1.2 DNA提取及PCR扩增
样品DNA提取采用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒。单头虫体用液氮研磨后，按照说明书进行提取，后利用纯化的DNA作为模板，对mtCOI基因片段进行PCR扩增。引物序列参照Nagoshi等[11]的设计，上游引物：5′-TTCGAGCTGAATTAGGGACT-3′，下游引物：5′-GATGTAAAATATGCTCGTGT-3′。PCR反应体系（13 μL）：DNA 模板1.5 μL，buffer 1.3 μL，上下游引物各0.26 μL，dNTP 0.26 μL，Taq酶0.13 μL，ddH2O 9.3 μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，34个循环;72℃延伸10 min。PCR扩增结束后，使用1%琼脂糖电泳检测扩增结果，选取与目标片段长度一致的单一片段PCR产物切胶、回收并送擎科生物股份有限公司测序。 1.3 数据分析
从GenBank数据库中下载部分已发布的草地贪夜蛾（已确认的玉米型和水稻型）对应基因序列，以棉铃虫mtCOI序列作为外群构建系统进化树。选取Kimura-2参数模型，依据邻接法（NJ）构建系统进化树，系统树各分支的自举检验值（bootstrap）1 000次重复检验。
2 结果与分析
2.1 草地贪夜蛾mtCOI单倍型判断与系统发育分析
将山东各地区样本的mtCOI基因序列进行比对分析，发现山东省的mtCOI基因仅有两个单倍型，分别命名为山东单倍型1和山东单倍型2。系统发育分析（图1）发现，山东单倍型1的mtCOI序列与来自中国广东、印度、巴西、南非、美国的水稻型序列聚在一起，应属于水稻型;山东单倍型2的序列与美国、中国广东、墨西哥玉米型序列聚在一起，应属于玉米型。
2.2 草地贪夜蛾mtCOI单倍型的分布
山东地区采集的49个个体中，山东单倍型1共46个，占93.9%，分布于青岛市城阳、即墨、胶州、平度和枣庄市滕州、日照市岚山、日照市五莲、临沂市临沭、临沂市郯城、烟台市海阳、威海市乳山、威海市荣成、烟台市牟平、聊城市东昌府、菏泽市东明和菏泽市鄄城共16个县（市、区）;山东单倍型2共3个个体，占6.1%，均出自济宁市梁山（表1，图2）。
3 讨论与结论
本研究以mtCOI作为分子标记，对首次入侵山东各地的草地贪夜蛾样本进行了分子鉴定，结果发现两个mtCOI单倍型，分别属于玉米型和水稻型，其中属于水稻型的单倍型样本占绝大多数，因此，入侵山东省的草地贪夜蛾并非单一来源。张磊等[14]研究发现，侵入中国地区的草地贪夜蛾的线粒体基因组以水稻型为主，玉米型仅占极少数。本试验结果与其基本一致。
草地贪夜蛾的不同亚型直接决定对寄主植物的取食偏好性。目前入侵的草地贪夜蛾以为害玉米为主，但也陆续发现其在小麦、花生、水稻和大豆等作物上的为害证据[15-17]。本研究通过分子鉴定，明确入侵山东草地贪夜蛾的线粒体单倍型构成，为进一步探究草地贪夜蛾寄主选择和种群遗传学信息的关系奠定了基础，对今后草地贪夜蛾的风险评估、精准监测预警和绿色防控具有重要指导意义。
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[17] 杨现明，孙小旭，赵胜园，等. 小麦田草地贪夜蛾的发生为害、空间分布与抽样技术[J/OL].植物保护，2019. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1982.S.20191106.0933.001.html.