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摘要
為探明土壤撒施石灰对西瓜枯萎病发生的影响，本试验设计5个浓度剂量的氧化钙对连作西瓜5年的土壤进行消毒处理，通过栽培感病品种并调查植株生长情况、枯萎病发病率等指标，结合土壤中尖孢镰刀菌西瓜专化型1号小种病原菌孢子量和土壤pH的变化动态，以此评估土壤施加石灰防治西瓜枯萎病的效果，并利用不同浓度的钙对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝生长和产孢量的影响进行防治机理的初步研究。试验结果表明，当土壤施加氧化钙后，西瓜发病率显著降低，各处理的相对防效分别为14%、57.8%、96.3%、94.7%、94.7%。在定植10 d后，各处理均有促进植株生长发育的作用，其中1.34 g/kg最显著。而随着氧化钙施加量的增加，土壤pH值也不断提高，30 d趋于稳定。对土壤病原菌孢子数量检测表明：各处理土壤中病原菌数量均呈现显著降低的趋势。PDA平板生测结果表明，当钙离子浓度高于80 mmol/L时，病原菌的生长及产孢量开始受到抑制，随着浓度的增加，抑制作用加强。土壤施加氧化钙不仅能改善土壤的酸化，还能有效防控西瓜枯萎病，其机理可能是土壤pH值的提高改变了土壤微环境，不利于病原菌侵染；施加的钙离子抑制了病原菌菌丝的生长及孢子的萌发。研究结果对揭示氧化钙防控西瓜枯萎病机制，具有一定的参考价值。
关键词
西瓜；氧化钙；枯萎病；尖孢镰刀菌西瓜专化型
中图分类号：
S 436.5
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.06.003
Effects of soil application with calcium oxide on control of Fusarium wilt of
watermelon and its preliminary mechanism research
Qiu Ting1，2，Zhang Yi2，Xiao Jiling2，Li Jiguang2，Zhu Feiying2，Wei Lin3，Liang Zhihuai1，2
（1. Longping Branch of Graduate School， Hunan University， Changsha410125， China；
2. Hunan Agricultural Biotechnology Research Center， Changsha410125， China；
3. Hunan Institute of Plant Protection， Changsha410125， China）
Abstract
In this study， five concentrations of soil calcium disinfection were used to evaluate the effects of calcium oxide on watermelon Fusarium wilt by the dynamic change of soil pH， the amount of Fusarium oxysporum f.sp. niveum in soil， the incidence of Fusarium wilt and plant growth. The results showed that， when the soil was applied with calcium oxide， the incidence of plant disease was significantly decreased， and the relative control rates of each treatment were 14%， 57.8%， 96.3%， 94.7%， and 94.7%， respectively. All treatments had the effect of promoting plant growth and development after 10 days of colonization， among which 1.34 g/kg treatment was the most significant. With the increase of calcium oxide application rate， the soil pH also increased and tended to be stable in 30 days. The research of F.oxysporum f.sp. niveum number showed that the number of pathogens in treated soils showed a significant decrease. PDA flat test results showed that， when calcium ion concentration was higher than 80 mmol/L， the growth of the pathogen and quantity of spore production began to be suppressed， and with the increase of concentration， the inhibition strengthened. Therefore， the application of calcium oxide in the soil could not only improve the soil acidification， but also effectively control watermelon wilt disease； the mechanism might be that the increase in soil pH changed the soil microenvironment， and the increase in free calcium concentration inhibited the growth of pathogens and spore germination， leading to its apoptosis. The results of the study have a reference value for revealing the mechanism of prevention and control of the fusarium wilt of watermelon by calcium oxide. Key words
watermelon；calcium oxide；Fusarium wilt；Fusarium oxysporum f.sp. niveum
石灰（CaO）消毒是一种全球性常见的农业改良措施。近年来，有关施用石灰改善酸性土壤，及对土壤微生物群落影响的研究日益增多，研究结果表明，合理施用石灰，可以提高土壤中的N、P、Ca、Mg有效性，降低Al、Mn的毒害，提高酸性土壤的生产力，减轻酸性土壤对作物生长不利的影响[13]。还可有效改善土壤微生物环境，提高土壤微生物C、N量、呼吸速率和代谢熵（qCO2）[45]。同时，也有研究表明，土壤中施用石灰，对黄瓜枯萎病[6]、根腐病[7]及水稻立枯病[8]等病害的发生还具有明显的防控效果。但是有关石灰施用对西瓜枯萎病防控效果及其防控机理的研究，却未见系统明确的报道。
西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型引起的一种毁灭性病害，已成为限制西瓜产业可持续发展的主要因素之一。目前生产上还没有彻底根治西瓜枯萎病的有效方法，只能及时发现病株尽快将其移除以防止病情的扩散，但生产中很难做到，往往导致极大的损失甚至毁种绝收。作者前期大量试验结果表明，在悉生条件下，当中性土壤中尖孢镰刀菌西瓜专化型1号小种孢子数量达到102个/g时，感病品种西瓜植株开始显症发病，当病原菌数量为103个/g时，感病品种发病率可达50%左右，而当孢子数量达到105个/g时，西瓜发病率为90%～100%。但在非悉生条件下，或者土壤理化性质发生变化，同样的病原菌数量和寄主互作，西瓜的发病率却往往不同于上述规律，有时甚至不发病。由此可见，在西瓜与病原菌互作中，环境因子往往起着较大的作用。本试验选取连作5年的西瓜土壤，种植感病西瓜品种，人为创造一种利于病害稳定发生的条件，构建一种寄主、病原菌以及土壤环境的互作体系。拟通过施加氧化钙，改变土壤pH、钙离子浓度等环境因子，来探索氧化钙的施用对西瓜枯萎病发生的影响作用及其初步机理，为西瓜枯萎病的防控提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验主要材料
供试西瓜品种为‘早佳8424’。尖孢镰刀菌西瓜专化型1号生理小种由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供。化学纯氧化钙购于西陇化工股份有限公司。供试土壤取自连作5年的大棚西瓜种植地，土壤性质为强酸性砂壤土。试验土样采用5点取样法取0～15 cm耕层，充分混匀后，取部分土样送至湖南省土壤检测中心检测。其理化性质检测结果如下：pH 5.3，有机质25.3 g/kg，全氮1.78 mg/kg，碱解氮123.7 mg/kg，有效磷126.9 mg/kg，速效钾144.0 mg/kg。
1.2试验方法
1.2.1试验设计
将供试大棚酸性土壤充分混匀，分装于40 cm×30 cm×30 cm试验盆中，每盆15 kg，试验共设计5个氧化钙浓度，分别为0.67（S1）、1.00（S2）、1.34（S3）、1.67（S4）、2.01（S5）g/kg，以不添加氧化钙为对照（CK），每处理5次重复，施加方式为，将氧化钙粉末溶于一定量水中，待热量全部释放，恢复常温后浇于试验盆中，维持田间最大持水量的60%，后期常规管理。放置7 d后，采取常规方法浸种催芽，播种，每盆播种30粒。
1.2.2测定方法
1.2.2.1枯萎病发病率
记录定植40 d时西瓜枯萎病发病株数，以发病率指标反映枯萎病发生情况。发病率（%）=病株数/总株数×100。
1.2.2.2植株生长指标的测定
按常规方法测定西瓜定植后第20、30和40天的蔓长（茎基部到植株生长点最顶端，米尺测定）以及地上部分的鲜重。
1.2.2.3土样采集及土壤性质检测
采用5点取样法收集0～15 cm土层样品，每个点取3个样，充分混匀，过20目筛，用于土壤环境因子以及尖孢镰刀菌西瓜专化型孢子数量检测。其中，土壤pH按水土比2.5∶1采用pH计测量，每次测量3次重复。土壤中尖孢镰刀菌孢子数量采用Komad[10]稀释平板法计数，每次检测3次重复。
1.2.2.4菌落培养性状的测量
采用菌丝生长速率法[11]配制含钙离子浓度为20、40、80、140、200、300 mmol/L的PDA培养基，充分混匀倒平板，每平板20 mL，待平板凝固后在平板中央接种尖孢镰刀菌西瓜专化型菌饼（直径4 mm，以不加钙的培养基为对照）。28℃黑暗培养，定期用十字交叉法计算菌落平均直径，按公式：菌丝生长抑制率（%）=[1-（处理菌落直径-菌饼直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）]×100求得菌丝生长抑制率，每处理3次重复。
1.2.2.5菌丝生长及產孢量的测定
①配制含20、40、80、140、200、300 mmol/L钙离子浓度的PD培养液。在培养的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌落边缘打取直径4 mm的菌饼，每瓶接种3个菌饼，每个处理3次重复，以不加钙离子的培养液为对照。25℃ 120 r/min振荡培养5 d后，真空抽滤滤出菌丝，用灭菌水冲洗3次，除去菌饼，与事先烘干至恒重的滤纸一同置于烘箱中烘干至恒重，称量菌丝重量。收集过滤孢子悬浮液，用血球计数板记录各处理的孢子浓度。
②将25℃ 120 r/min振荡培养5 d的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌悬液过滤，收集孢子悬浮液，用血球计数板计数孢子浓度。再将孢子悬浮液分装于100 mL锥形瓶中，添加含钙离子溶液，配制成含80、140、200 mmol/L钙离子带菌悬浮液，每处理3次重复，继续摇瓶培养，每隔2 d，用血球计数板计数各处理的孢子浓度。
1.3数据与分析
采用Excel 2013软件处理数据和作图，用SPSS软件进行统计分析，采用LSD法检验处理间差异显著性，显著性水平设定为P=0.05。 2结果与分析
2.1不同浓度氧化钙处理对西瓜植株枯萎病发病率的影响
定植后30 d，CK始见西瓜枯萎病，此后CK、S1及S2处理发病逐步加重，在定植后35 d开花幼果期前后发病最为严重，之后发病情况逐步减少。由图1所知，在定植40 d时，施加氧化钙0.67、1.00、1.34、1.67 g/kg及2.01 g/kg处理植株发病率分别为53.3%、26.7%、2.3%、3.3%、3.3%，显著低于（P<0. 05）对照CK发病率63.3%。通过防效对比来看，各浓度处理对西瓜枯萎病相对防效分别达到14%、57.8%、96.3%、94.7%、94.7%。
2.2不同浓度氧化钙处理对西瓜植株生长的影响
由图2可知，在定植后整个生长过程中，各处理均对植株蔓长（图2a）以及地上鲜重部分（图2b）有一定的促进作用，其中S3处理的促进作用最明显。当石灰用量小于1.34 g/kg时，随着用量的增加，促进作用增强，而当石灰用量大于1.34 g/kg时，随着用量的增加，植株的蔓长及鲜重呈下降趋势。
2.3不同浓度氧化钙处理对土壤pH动态变化的影响
盆栽试验土为5年西瓜连作土壤，处理前土壤pH保持在5.0～5.5之间，呈现强酸性。如图3所示，CK处理各时期一直平稳地维持在5.3左右，而其他处理土壤pH均有不同程度提高。根据土壤pH分类标准，S1处理将土壤pH由强酸段提高到酸性段（pH 5.5～6.0之间），S2处理土壤pH由强酸段提高到弱酸段（pH 6.0～6.5之间），S3处理土壤pH由强酸段提高到中性段（pH 6.5～7.0之间），S4及S5处理则提高到弱碱段（pH 7.0～7.5之间），且各处理均在定植30 d后趋于稳定。
2.4不同浓度氧化钙处理对土壤中尖孢镰刀菌西瓜专化型孢子数量的影响
如图4所示，比较5种浓度氧化钙处理下土壤中尖孢镰刀菌孢子数量变化发现，各处理的土壤中尖孢镰刀菌孢子数量呈现降低的趋势，均与对照达到显著差异水平。其中各处理在0～10 d内尖孢镰刀菌孢子量下降最明显，分别下降13.2%、32.1%、60.7%、82.8%、89.2%。而对照组CK土壤病原菌量在0～10 d却有所上升。而在整个西瓜生长过程中，病原菌数量一直表现为CK>S1>S2>S3>S4>S5。
2.5不同浓度钙离子对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌落生长的影响
在含有不同浓度钙离子的PDA培养基上进行抑菌试验，表1结果表明：除低浓度钙离子处理以外，抑菌效果随浓度的增加而增强，但随着处理天数的延长，抑菌效果逐渐减弱。20 mmol/L浓度钙离子在培养过程中均表现出对病原菌生长的促进作用，比对照处理生长速度快。培养2 d调查发现，钙离子浓度40～300 mmol/L的抑菌效果逐渐增强，抑菌率为2.09%～60.25%；培养5 d时，40～80 mmol/L表现出促进病原菌生长，且均与对照呈显著差异，140～300 mmol/L抑菌作用减弱，抑菌率降至20.91%～26.65%。培养7 d时，140～300 mmol/L抑菌率降至8.69%～18.53%。
2.6不同浓度钙离子对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝生长及产孢量的影响
图5、图6结果显示，钙离子低于40 mmol/L对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝生长无抑制作用，菌丝生长量与对照差异不显著，但对其产孢促进作用显著。随着钙离子浓度增加至80～120 mmol/L时，病原菌产孢开始受到抑制，且随着钙离子浓度的增加，抑制作用也增强，产孢量分别降低了15.4%和32.7%，而对菌丝生长量仍无明显影响。当浓度达到200～300 mmol/L，菌丝生长以及产孢均受到明显抑制，其中300 mmol/L抑制效果最好，孢子浓度降低2个数量级。
试验初始孢子浓度为1.63×107个/mL。由图7可以看出，在培养期间，钙离子能显著减少尖孢镰刀菌西瓜专化型的孢子数量，抑制孢子的萌发。而且随着钙离子浓度的增加，病原菌孢子数量减少的愈明显。在处理后的第4天，当对照组病原菌孢子数量达到最大值时，此时钙离子浓度为80、140和200 mmol/L的处理孢子数量相对于对照均降低2个数量级，且3种浓度间均达到显著性差异。
3讨论
西瓜连作障碍是由多种病原真菌引起的植物毁灭性病害，其病原菌主要是引起植物病害的真菌和部分细菌[12]。本试验供试土壤连作障碍较显著，属于枯萎病高发区域。目前土壤消毒仍然是克服连作障碍，减缓病害发生的有效方法。研究表明对连作土壤进行灭菌处理能较大程度改善草莓[1315]、葡萄[16]、平邑甜茶[17]和辣椒[18]等作物的连作障碍，减轻土传病害，促进作物生长。石灰作为一种高效无残留的土壤消毒剂，能够有效地降低土壤中病原菌、线虫等各种有害生物的種群数量，对半知菌亚门的镰刀菌有较好的防治效果。本试验通过对添加氧化钙土壤中尖孢镰刀菌西瓜专化型孢子数量的监测，发现在定植10 d以后，1.34、1.67、2.01 g/kg氧化钙处理病原菌孢子数量由基数2.53×104个/g分别降低至1.1×104、4.8×103、3.0×103个/g。在定植20 d到40 d间土壤中尖孢镰刀菌孢子量呈持续降低趋势，其中1.67和2.01 g/kg氧化钙处理的病原菌数量与对照差异达到10倍的数量级，说明氧化钙的施加能杀死部分连作西瓜土壤中的西瓜专化型尖孢镰刀菌，在一定程度上减轻了西瓜枯萎病的发生，这也与方组柽[19]利用石灰处理水稻，减少稻纹枯菌的数量，减轻稻纹枯病的发生这一结论相符合。另外，我们发现，在西瓜生长过程中对照也同其他处理一样，土壤中病原菌总体呈现降低的趋势，其降低的主要原因还需要进一步研究。
土壤酸碱度直接影响着土壤中微生物生态变化动向和强度。有资料显示[20]，在作物连作情况下，由于植物根系在生长过程中会分泌一些酸性物质，随着连作时间的延长，土壤酸度越来越高。而土壤中存在着大量只适合生长在pH为6.5～7.5的中性环境条件下的有益微生物，随着土壤pH降低，这些微生物的种类和活性都随之降低，土壤趋于真菌化[9]，病害的发生加重。刘炳君等[21]利用石灰调节茶园pH，酸性土壤pH经调节提高1～2，引起土壤细菌数量增加10倍以上，而真菌数量随pH的增加而减少。本试验土壤为5年西瓜连作土，土壤酸化严重，pH保持在5.0～5.5之间，前期研究发现利用石灰氮[22]、生物炭[23]等物质均能有效提高土壤pH，达到减轻枯萎病发生的效果，还能促进植物的生长发育。班洁静等[24]通过设置不同pH梯度，研究土壤pH对芸薹根瘤菌侵染及病害发生的影响，研究发现，pH为5.0的处理病情指数与发病率最高，根部肿大，pH为6.0的处理病情指数与发病率明显降低，且根系生长健康，根部肿大不明显。姚燕来等[25]通过实验室模拟试验，发现尖孢镰刀菌黄瓜专化型在酸性土壤中增殖速率显著提高，而中性或碱性土壤中增殖速率较低。在本研究中，氧化钙处理对土壤的pH改变有一定效果，并且土壤病原菌数量结果显示，在定植40 d时，1.34、1.67及2.01 g/kg浓度氧化钙处理土壤病原菌孢子数量均降低至103数量级，发病较轻。前期试验表明，当土壤病原菌达到103个/g土时，植株发病较为严重。由此可以认为土壤pH是影响西瓜枯萎病发生的重要环境因子之一，在中性及弱碱性条件下，不利于病原菌的侵染，但其是因为改变土壤微生物种群结构来影响病原菌的侵染，还是通过提高植株对土壤营养元素的吸收，提高抗性来降低枯萎病的发生仍需进一步研究。 土壤施加氧化钙不但提高了土壤pH，还大大增加了土壤中钙离子含量。有研究表明，细胞质钙离子浓度的改变可调节多种细胞活动，细胞对游离钙水平升高的反应，取决于钙信号持续的时间及强度，高浓度长时间的游离钙水平升高会抑制细胞活动，促使细胞凋亡[26]。魏光等[8]在土壤施钙对水稻秧苗根系微生物影响的研究中发现，1.0%钙处理浓度对秧苗根际土壤真菌的繁殖和生长表现出明显的抑制作用。而本试验抑菌试验结果也表明，当钙离子浓度高于80 mmol/L时，尖孢镰刀菌西瓜专化型的生长及孢子萌发均开始受到抑制，浓度越高，抑制作用越显著。并且当钙离子浓度达到200 mmol/L时，尖孢镰刀菌的数量下降2个数量级。这也是添加氧化钙高浓度时能够降低病原菌数量，缓解西瓜枯萎病的重要原因。另外钙离子作为植物细胞内第二信使，当植物受到病原物侵染后，会诱导一系列防卫反应。在西瓜植株与病原菌互作中，是如何通过协调 Ca2 介导的反应实现最有效的免疫仍需进一步研究。
4结论
本研究通过对酸性连作土壤进行不同浓度氧化钙处理，发现施加氧化钙能够有效防治西瓜枯萎病，降低病原菌的数量，促进西瓜植株的生长，其最佳施用量为1.34 g/kg，最大防效为96.3%。初步可认为防治机理为添加氧化钙提高了土壤的pH值，在中性及弱碱性条件下，不利于病原菌的侵染，是影响西瓜枯萎病发生的重要环境因子。此外，氧化钙的施入提高了土壤中游离钙离子浓度，高浓度的游离钙离子浓度能够抑制病原菌细胞的活动，促使细胞凋亡。
参考文献
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（责任编辑：田喆）
為探明土壤撒施石灰对西瓜枯萎病发生的影响，本试验设计5个浓度剂量的氧化钙对连作西瓜5年的土壤进行消毒处理，通过栽培感病品种并调查植株生长情况、枯萎病发病率等指标，结合土壤中尖孢镰刀菌西瓜专化型1号小种病原菌孢子量和土壤pH的变化动态，以此评估土壤施加石灰防治西瓜枯萎病的效果，并利用不同浓度的钙对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝生长和产孢量的影响进行防治机理的初步研究。试验结果表明，当土壤施加氧化钙后，西瓜发病率显著降低，各处理的相对防效分别为14%、57.8%、96.3%、94.7%、94.7%。在定植10 d后，各处理均有促进植株生长发育的作用，其中1.34 g/kg最显著。而随着氧化钙施加量的增加，土壤pH值也不断提高，30 d趋于稳定。对土壤病原菌孢子数量检测表明：各处理土壤中病原菌数量均呈现显著降低的趋势。PDA平板生测结果表明，当钙离子浓度高于80 mmol/L时，病原菌的生长及产孢量开始受到抑制，随着浓度的增加，抑制作用加强。土壤施加氧化钙不仅能改善土壤的酸化，还能有效防控西瓜枯萎病，其机理可能是土壤pH值的提高改变了土壤微环境，不利于病原菌侵染；施加的钙离子抑制了病原菌菌丝的生长及孢子的萌发。研究结果对揭示氧化钙防控西瓜枯萎病机制，具有一定的参考价值。
关键词
西瓜；氧化钙；枯萎病；尖孢镰刀菌西瓜专化型
中图分类号：
S 436.5
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.06.003
Effects of soil application with calcium oxide on control of Fusarium wilt of
watermelon and its preliminary mechanism research
Qiu Ting1，2，Zhang Yi2，Xiao Jiling2，Li Jiguang2，Zhu Feiying2，Wei Lin3，Liang Zhihuai1，2
（1. Longping Branch of Graduate School， Hunan University， Changsha410125， China；
2. Hunan Agricultural Biotechnology Research Center， Changsha410125， China；
3. Hunan Institute of Plant Protection， Changsha410125， China）
Abstract
In this study， five concentrations of soil calcium disinfection were used to evaluate the effects of calcium oxide on watermelon Fusarium wilt by the dynamic change of soil pH， the amount of Fusarium oxysporum f.sp. niveum in soil， the incidence of Fusarium wilt and plant growth. The results showed that， when the soil was applied with calcium oxide， the incidence of plant disease was significantly decreased， and the relative control rates of each treatment were 14%， 57.8%， 96.3%， 94.7%， and 94.7%， respectively. All treatments had the effect of promoting plant growth and development after 10 days of colonization， among which 1.34 g/kg treatment was the most significant. With the increase of calcium oxide application rate， the soil pH also increased and tended to be stable in 30 days. The research of F.oxysporum f.sp. niveum number showed that the number of pathogens in treated soils showed a significant decrease. PDA flat test results showed that， when calcium ion concentration was higher than 80 mmol/L， the growth of the pathogen and quantity of spore production began to be suppressed， and with the increase of concentration， the inhibition strengthened. Therefore， the application of calcium oxide in the soil could not only improve the soil acidification， but also effectively control watermelon wilt disease； the mechanism might be that the increase in soil pH changed the soil microenvironment， and the increase in free calcium concentration inhibited the growth of pathogens and spore germination， leading to its apoptosis. The results of the study have a reference value for revealing the mechanism of prevention and control of the fusarium wilt of watermelon by calcium oxide. Key words
watermelon；calcium oxide；Fusarium wilt；Fusarium oxysporum f.sp. niveum
石灰（CaO）消毒是一种全球性常见的农业改良措施。近年来，有关施用石灰改善酸性土壤，及对土壤微生物群落影响的研究日益增多，研究结果表明，合理施用石灰，可以提高土壤中的N、P、Ca、Mg有效性，降低Al、Mn的毒害，提高酸性土壤的生产力，减轻酸性土壤对作物生长不利的影响[13]。还可有效改善土壤微生物环境，提高土壤微生物C、N量、呼吸速率和代谢熵（qCO2）[45]。同时，也有研究表明，土壤中施用石灰，对黄瓜枯萎病[6]、根腐病[7]及水稻立枯病[8]等病害的发生还具有明显的防控效果。但是有关石灰施用对西瓜枯萎病防控效果及其防控机理的研究，却未见系统明确的报道。
西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型引起的一种毁灭性病害，已成为限制西瓜产业可持续发展的主要因素之一。目前生产上还没有彻底根治西瓜枯萎病的有效方法，只能及时发现病株尽快将其移除以防止病情的扩散，但生产中很难做到，往往导致极大的损失甚至毁种绝收。作者前期大量试验结果表明，在悉生条件下，当中性土壤中尖孢镰刀菌西瓜专化型1号小种孢子数量达到102个/g时，感病品种西瓜植株开始显症发病，当病原菌数量为103个/g时，感病品种发病率可达50%左右，而当孢子数量达到105个/g时，西瓜发病率为90%～100%。但在非悉生条件下，或者土壤理化性质发生变化，同样的病原菌数量和寄主互作，西瓜的发病率却往往不同于上述规律，有时甚至不发病。由此可见，在西瓜与病原菌互作中，环境因子往往起着较大的作用。本试验选取连作5年的西瓜土壤，种植感病西瓜品种，人为创造一种利于病害稳定发生的条件，构建一种寄主、病原菌以及土壤环境的互作体系。拟通过施加氧化钙，改变土壤pH、钙离子浓度等环境因子，来探索氧化钙的施用对西瓜枯萎病发生的影响作用及其初步机理，为西瓜枯萎病的防控提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验主要材料
供试西瓜品种为‘早佳8424’。尖孢镰刀菌西瓜专化型1号生理小种由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供。化学纯氧化钙购于西陇化工股份有限公司。供试土壤取自连作5年的大棚西瓜种植地，土壤性质为强酸性砂壤土。试验土样采用5点取样法取0～15 cm耕层，充分混匀后，取部分土样送至湖南省土壤检测中心检测。其理化性质检测结果如下：pH 5.3，有机质25.3 g/kg，全氮1.78 mg/kg，碱解氮123.7 mg/kg，有效磷126.9 mg/kg，速效钾144.0 mg/kg。
1.2试验方法
1.2.1试验设计
将供试大棚酸性土壤充分混匀，分装于40 cm×30 cm×30 cm试验盆中，每盆15 kg，试验共设计5个氧化钙浓度，分别为0.67（S1）、1.00（S2）、1.34（S3）、1.67（S4）、2.01（S5）g/kg，以不添加氧化钙为对照（CK），每处理5次重复，施加方式为，将氧化钙粉末溶于一定量水中，待热量全部释放，恢复常温后浇于试验盆中，维持田间最大持水量的60%，后期常规管理。放置7 d后，采取常规方法浸种催芽，播种，每盆播种30粒。
1.2.2测定方法
1.2.2.1枯萎病发病率
记录定植40 d时西瓜枯萎病发病株数，以发病率指标反映枯萎病发生情况。发病率（%）=病株数/总株数×100。
1.2.2.2植株生长指标的测定
按常规方法测定西瓜定植后第20、30和40天的蔓长（茎基部到植株生长点最顶端，米尺测定）以及地上部分的鲜重。
1.2.2.3土样采集及土壤性质检测
采用5点取样法收集0～15 cm土层样品，每个点取3个样，充分混匀，过20目筛，用于土壤环境因子以及尖孢镰刀菌西瓜专化型孢子数量检测。其中，土壤pH按水土比2.5∶1采用pH计测量，每次测量3次重复。土壤中尖孢镰刀菌孢子数量采用Komad[10]稀释平板法计数，每次检测3次重复。
1.2.2.4菌落培养性状的测量
采用菌丝生长速率法[11]配制含钙离子浓度为20、40、80、140、200、300 mmol/L的PDA培养基，充分混匀倒平板，每平板20 mL，待平板凝固后在平板中央接种尖孢镰刀菌西瓜专化型菌饼（直径4 mm，以不加钙的培养基为对照）。28℃黑暗培养，定期用十字交叉法计算菌落平均直径，按公式：菌丝生长抑制率（%）=[1-（处理菌落直径-菌饼直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）]×100求得菌丝生长抑制率，每处理3次重复。
1.2.2.5菌丝生长及產孢量的测定
①配制含20、40、80、140、200、300 mmol/L钙离子浓度的PD培养液。在培养的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌落边缘打取直径4 mm的菌饼，每瓶接种3个菌饼，每个处理3次重复，以不加钙离子的培养液为对照。25℃ 120 r/min振荡培养5 d后，真空抽滤滤出菌丝，用灭菌水冲洗3次，除去菌饼，与事先烘干至恒重的滤纸一同置于烘箱中烘干至恒重，称量菌丝重量。收集过滤孢子悬浮液，用血球计数板记录各处理的孢子浓度。
②将25℃ 120 r/min振荡培养5 d的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌悬液过滤，收集孢子悬浮液，用血球计数板计数孢子浓度。再将孢子悬浮液分装于100 mL锥形瓶中，添加含钙离子溶液，配制成含80、140、200 mmol/L钙离子带菌悬浮液，每处理3次重复，继续摇瓶培养，每隔2 d，用血球计数板计数各处理的孢子浓度。
1.3数据与分析
采用Excel 2013软件处理数据和作图，用SPSS软件进行统计分析，采用LSD法检验处理间差异显著性，显著性水平设定为P=0.05。 2结果与分析
2.1不同浓度氧化钙处理对西瓜植株枯萎病发病率的影响
定植后30 d，CK始见西瓜枯萎病，此后CK、S1及S2处理发病逐步加重，在定植后35 d开花幼果期前后发病最为严重，之后发病情况逐步减少。由图1所知，在定植40 d时，施加氧化钙0.67、1.00、1.34、1.67 g/kg及2.01 g/kg处理植株发病率分别为53.3%、26.7%、2.3%、3.3%、3.3%，显著低于（P<0. 05）对照CK发病率63.3%。通过防效对比来看，各浓度处理对西瓜枯萎病相对防效分别达到14%、57.8%、96.3%、94.7%、94.7%。
2.2不同浓度氧化钙处理对西瓜植株生长的影响
由图2可知，在定植后整个生长过程中，各处理均对植株蔓长（图2a）以及地上鲜重部分（图2b）有一定的促进作用，其中S3处理的促进作用最明显。当石灰用量小于1.34 g/kg时，随着用量的增加，促进作用增强，而当石灰用量大于1.34 g/kg时，随着用量的增加，植株的蔓长及鲜重呈下降趋势。
2.3不同浓度氧化钙处理对土壤pH动态变化的影响
盆栽试验土为5年西瓜连作土壤，处理前土壤pH保持在5.0～5.5之间，呈现强酸性。如图3所示，CK处理各时期一直平稳地维持在5.3左右，而其他处理土壤pH均有不同程度提高。根据土壤pH分类标准，S1处理将土壤pH由强酸段提高到酸性段（pH 5.5～6.0之间），S2处理土壤pH由强酸段提高到弱酸段（pH 6.0～6.5之间），S3处理土壤pH由强酸段提高到中性段（pH 6.5～7.0之间），S4及S5处理则提高到弱碱段（pH 7.0～7.5之间），且各处理均在定植30 d后趋于稳定。
2.4不同浓度氧化钙处理对土壤中尖孢镰刀菌西瓜专化型孢子数量的影响
如图4所示，比较5种浓度氧化钙处理下土壤中尖孢镰刀菌孢子数量变化发现，各处理的土壤中尖孢镰刀菌孢子数量呈现降低的趋势，均与对照达到显著差异水平。其中各处理在0～10 d内尖孢镰刀菌孢子量下降最明显，分别下降13.2%、32.1%、60.7%、82.8%、89.2%。而对照组CK土壤病原菌量在0～10 d却有所上升。而在整个西瓜生长过程中，病原菌数量一直表现为CK>S1>S2>S3>S4>S5。
2.5不同浓度钙离子对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌落生长的影响
在含有不同浓度钙离子的PDA培养基上进行抑菌试验，表1结果表明：除低浓度钙离子处理以外，抑菌效果随浓度的增加而增强，但随着处理天数的延长，抑菌效果逐渐减弱。20 mmol/L浓度钙离子在培养过程中均表现出对病原菌生长的促进作用，比对照处理生长速度快。培养2 d调查发现，钙离子浓度40～300 mmol/L的抑菌效果逐渐增强，抑菌率为2.09%～60.25%；培养5 d时，40～80 mmol/L表现出促进病原菌生长，且均与对照呈显著差异，140～300 mmol/L抑菌作用减弱，抑菌率降至20.91%～26.65%。培养7 d时，140～300 mmol/L抑菌率降至8.69%～18.53%。
2.6不同浓度钙离子对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝生长及产孢量的影响
图5、图6结果显示，钙离子低于40 mmol/L对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝生长无抑制作用，菌丝生长量与对照差异不显著，但对其产孢促进作用显著。随着钙离子浓度增加至80～120 mmol/L时，病原菌产孢开始受到抑制，且随着钙离子浓度的增加，抑制作用也增强，产孢量分别降低了15.4%和32.7%，而对菌丝生长量仍无明显影响。当浓度达到200～300 mmol/L，菌丝生长以及产孢均受到明显抑制，其中300 mmol/L抑制效果最好，孢子浓度降低2个数量级。
试验初始孢子浓度为1.63×107个/mL。由图7可以看出，在培养期间，钙离子能显著减少尖孢镰刀菌西瓜专化型的孢子数量，抑制孢子的萌发。而且随着钙离子浓度的增加，病原菌孢子数量减少的愈明显。在处理后的第4天，当对照组病原菌孢子数量达到最大值时，此时钙离子浓度为80、140和200 mmol/L的处理孢子数量相对于对照均降低2个数量级，且3种浓度间均达到显著性差异。
3讨论
西瓜连作障碍是由多种病原真菌引起的植物毁灭性病害，其病原菌主要是引起植物病害的真菌和部分细菌[12]。本试验供试土壤连作障碍较显著，属于枯萎病高发区域。目前土壤消毒仍然是克服连作障碍，减缓病害发生的有效方法。研究表明对连作土壤进行灭菌处理能较大程度改善草莓[1315]、葡萄[16]、平邑甜茶[17]和辣椒[18]等作物的连作障碍，减轻土传病害，促进作物生长。石灰作为一种高效无残留的土壤消毒剂，能够有效地降低土壤中病原菌、线虫等各种有害生物的種群数量，对半知菌亚门的镰刀菌有较好的防治效果。本试验通过对添加氧化钙土壤中尖孢镰刀菌西瓜专化型孢子数量的监测，发现在定植10 d以后，1.34、1.67、2.01 g/kg氧化钙处理病原菌孢子数量由基数2.53×104个/g分别降低至1.1×104、4.8×103、3.0×103个/g。在定植20 d到40 d间土壤中尖孢镰刀菌孢子量呈持续降低趋势，其中1.67和2.01 g/kg氧化钙处理的病原菌数量与对照差异达到10倍的数量级，说明氧化钙的施加能杀死部分连作西瓜土壤中的西瓜专化型尖孢镰刀菌，在一定程度上减轻了西瓜枯萎病的发生，这也与方组柽[19]利用石灰处理水稻，减少稻纹枯菌的数量，减轻稻纹枯病的发生这一结论相符合。另外，我们发现，在西瓜生长过程中对照也同其他处理一样，土壤中病原菌总体呈现降低的趋势，其降低的主要原因还需要进一步研究。
土壤酸碱度直接影响着土壤中微生物生态变化动向和强度。有资料显示[20]，在作物连作情况下，由于植物根系在生长过程中会分泌一些酸性物质，随着连作时间的延长，土壤酸度越来越高。而土壤中存在着大量只适合生长在pH为6.5～7.5的中性环境条件下的有益微生物，随着土壤pH降低，这些微生物的种类和活性都随之降低，土壤趋于真菌化[9]，病害的发生加重。刘炳君等[21]利用石灰调节茶园pH，酸性土壤pH经调节提高1～2，引起土壤细菌数量增加10倍以上，而真菌数量随pH的增加而减少。本试验土壤为5年西瓜连作土，土壤酸化严重，pH保持在5.0～5.5之间，前期研究发现利用石灰氮[22]、生物炭[23]等物质均能有效提高土壤pH，达到减轻枯萎病发生的效果，还能促进植物的生长发育。班洁静等[24]通过设置不同pH梯度，研究土壤pH对芸薹根瘤菌侵染及病害发生的影响，研究发现，pH为5.0的处理病情指数与发病率最高，根部肿大，pH为6.0的处理病情指数与发病率明显降低，且根系生长健康，根部肿大不明显。姚燕来等[25]通过实验室模拟试验，发现尖孢镰刀菌黄瓜专化型在酸性土壤中增殖速率显著提高，而中性或碱性土壤中增殖速率较低。在本研究中，氧化钙处理对土壤的pH改变有一定效果，并且土壤病原菌数量结果显示，在定植40 d时，1.34、1.67及2.01 g/kg浓度氧化钙处理土壤病原菌孢子数量均降低至103数量级，发病较轻。前期试验表明，当土壤病原菌达到103个/g土时，植株发病较为严重。由此可以认为土壤pH是影响西瓜枯萎病发生的重要环境因子之一，在中性及弱碱性条件下，不利于病原菌的侵染，但其是因为改变土壤微生物种群结构来影响病原菌的侵染，还是通过提高植株对土壤营养元素的吸收，提高抗性来降低枯萎病的发生仍需进一步研究。 土壤施加氧化钙不但提高了土壤pH，还大大增加了土壤中钙离子含量。有研究表明，细胞质钙离子浓度的改变可调节多种细胞活动，细胞对游离钙水平升高的反应，取决于钙信号持续的时间及强度，高浓度长时间的游离钙水平升高会抑制细胞活动，促使细胞凋亡[26]。魏光等[8]在土壤施钙对水稻秧苗根系微生物影响的研究中发现，1.0%钙处理浓度对秧苗根际土壤真菌的繁殖和生长表现出明显的抑制作用。而本试验抑菌试验结果也表明，当钙离子浓度高于80 mmol/L时，尖孢镰刀菌西瓜专化型的生长及孢子萌发均开始受到抑制，浓度越高，抑制作用越显著。并且当钙离子浓度达到200 mmol/L时，尖孢镰刀菌的数量下降2个数量级。这也是添加氧化钙高浓度时能够降低病原菌数量，缓解西瓜枯萎病的重要原因。另外钙离子作为植物细胞内第二信使，当植物受到病原物侵染后，会诱导一系列防卫反应。在西瓜植株与病原菌互作中，是如何通过协调 Ca2 介导的反应实现最有效的免疫仍需进一步研究。
4结论
本研究通过对酸性连作土壤进行不同浓度氧化钙处理，发现施加氧化钙能够有效防治西瓜枯萎病，降低病原菌的数量，促进西瓜植株的生长，其最佳施用量为1.34 g/kg，最大防效为96.3%。初步可认为防治机理为添加氧化钙提高了土壤的pH值，在中性及弱碱性条件下，不利于病原菌的侵染，是影响西瓜枯萎病发生的重要环境因子。此外，氧化钙的施入提高了土壤中游离钙离子浓度，高浓度的游离钙离子浓度能够抑制病原菌细胞的活动，促使细胞凋亡。
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（责任编辑：田喆）