【摘 要】
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为了建立一种敏感、特异的牛冠状病毒（BCoV）实时荧光定量RT-PCR检测方法，试验利用GenBank中BCoV参考毒株N基因序列，设计引物及小沟结合物（MGB）探针，建立实时荧光定量RT-PCR方法，对方法的特异性、灵敏度和稳定性进行检验。利用建立的方法对采集自7个省份31个发病牛场的925份临床样本进行检测，并用基于BCoV N基因的普通RT-PCR结合测序的方法对部分阳性样品进行验证。结果表
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为了建立一种敏感、特异的牛冠状病毒（BCoV）实时荧光定量RT-PCR检测方法，试验利用GenBank中BCoV参考毒株N基因序列，设计引物及小沟结合物（MGB）探针，建立实时荧光定量RT-PCR方法，对方法的特异性、灵敏度和稳定性进行检验。利用建立的方法对采集自7个省份31个发病牛场的925份临床样本进行检测，并用基于BCoV N基因的普通RT-PCR结合测序的方法对部分阳性样品进行验证。结果表明：建立的实时荧光定量RT-PCR方法的扩增体系为上下游引物（10μmol/L）各1μL,探针（10μmol/L）0.8μL,2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL,Ex Taq HS （5 U/μL） 0.4μL,Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μL,总RNA 2μL,ddH2O 4.4μL;扩增程序为，42℃5 min; 95℃10 s; 95℃5 s, 55℃35 s, 40个循环。标准曲线方程为y=40.979-3.512x,可信度（R~2）为0.999,扩增效率（E）为92.6%,最低检测限为48 copies/μL,重复性变异系数（CV）不超过0.82%。31个发病牛场BCoV阳性场占比为64.52%（20/31）,其中腹泻症状阳性场占比为54.55%（12/22）,呼吸道症状阳性场占比为65.22%（15/23）;阳性样品经基于BCoV N基因的普通RT-PCR方法验证，测序正确。说明建立的BCoV实时荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、稳定性好，能检测出临床样本中的BCoV核酸，可应用于BCoV感染的诊断、监测与流行病学调查。
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