【摘 要】
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目的:探讨重组人转化生长因子(TGF)-β1荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况.方法:体外酶消化分离法培养兔关节软骨细胞并采用特异性细胞外基质Ⅱ型胶原免疫细胞
【机 构】
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广州医学院第三附属医院骨外科,中山大学附属第三医院骨外科
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目的:探讨重组人转化生长因子(TGF)-β1荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况.方法:体外酶消化分离法培养兔关节软骨细胞并采用特异性细胞外基质Ⅱ型胶原免疫细胞染色进行鉴定.双酶切法切取TGF-β1的cDNA片段,通过T4 DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上构建pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒.用构建的pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒经脂质体转染软骨细胞,在12、24 h、2、4、6 d通过荧光显微镜观察细胞内TGF-β1基因的表达,应用荧光定量PCR检测表达水平.结果:成功分离培养软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞染色显示细胞胞质染成棕黄色,胞核基本不着色.pEGFP-C1-TGF-β1真核表达载体质粒成功构建,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确.荧光显微镜观察转染后的软骨细胞有绿色荧光蛋白表达,软骨细胞的转染率分别为12 h:(8.22±2.02)%,24 h:(16.54 4±2.91)%,2 d:(14.06±3.67)%,4 d:(14.24±2.62)%,6 d:(12.36±2.28)%.荧光定量PCR检测转染软骨细胞TGF-β1基因拷贝数为16 277±1779,高于未转染软骨细胞的3095±205(P
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