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摘 要 通过超声波辅助提取冬青叶总黄酮，构建了铝盐双波长比色法检测总黄酮模型，优化了冬青叶总黄酮的测定方法，其测定波长为510 nm，参比波长为450 nm，在0.00～39.29 μg·mL-1时可用于测定冬青总黄酮，拟合的芦丁标准曲线方程为Y=0.017X-0.000 8，R2=0.999 3。通过该方法测定冬青叶中总黄酮的含量为2.21%～2.55%（n=6）。铝盐双波长比色法可用于快捷简便地测定冬青叶中的总黄酮含量。
关键词 冬青;总黄酮;含量测定;铝盐双波长比色法
中图分类号：R284.1 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.06.067
冬青（Ilex chinensis Sims）为冬青科Aquifoliaceae冬青属Ilex多年生植物，我国主产于安徽省、江西省、浙江省、两湖两广等江南各省，一般生长于海拔500～1 000 m
的山坡常绿阔叶林中和林缘地带。冬青属植物多用于清热解毒、消炎、镇咳祛痰及治疗心血管疾病。冬青的根、种子、树皮均可入药，其叶有清热利湿、消肿镇痛之功效，用于肺炎、急性咽喉炎症、痢疾、胆道感染、外治烧伤、下肢溃疡、皮炎湿疹、脚手皮裂等[1-3]。现代医学研究表明，黄酮类是冬青主要活性成分之一，其具有明显的降压降脂、抗菌消炎及抗肿瘤等药理功能。在对冬青叶中总黄酮含量进行测定时，发现其直接测定结果偏高;与文献报道冬青叶总黄酮的含量存在较大差异（一般<3%）。基于此，拟采用双波长等方法对冬青叶中总黄酮含量测定体系进行研究，以优化和改进总黄酮含量测定体系。
1 材料与方法
实验仪器主要有超纯水制备系统（P20-Y，长沙源科仪），电子天平（1/100 000，AG285，METTLE TOLEDO），紫外可见分光光度仪（UV2550，岛津），超声波提取器（昆山市超声提取有限公司），万能高速粉碎机（天津市斯泰勒仪器有限公司）。实验试剂包括芦丁标准样品（融禾公司生产）及以下为分析纯试剂：乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠;实验用水为超纯水。实验材料冬青叶于60 ℃恒温干燥，粉碎，过70目筛，装袋备用。
实验方法主要参考刘亚倩等[4-6]研究者进行芦丁标准曲线的制备、冬青总黄酮供试品溶液的提取富集、总黄酮含量的检测等步骤，并在此基础上改进冬青叶总黄酮检测方法。具体步骤如下。
1.1 标准曲线的制备
准确移取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、15.0 mL的0.2 mg·mL-1芦丁标准溶液，分别置于50 mL比色管中，加1.50 mL5.0%亚硝酸钠溶液，摇匀后静置11 min，加入1.50 mL10.0%硝酸铝溶液，摇匀，静置12 min后加入10 mL4.0%氢氧化钠溶液，摇匀，静置20 min，于510 nm及参比波长450 nm处测定其吸光值，记录下不同浓度吸光值。运用Excel等软件，以浓度为X轴，吸光值差值为Y轴绘制标准曲线方程Y=0.017X-0.000 8，Y吸光度，X为浓度，R2=0.999 3，在（0，39.29]μg·mL-1检测范围内符合该方程
1.2 供试品溶液的制备
准确称取0.250 g冬青样品于50 mL容量瓶中，用60%乙醇20 mL超声提取30 min后取出定容，过滤，滤液即为待测供试品溶液。
1.3 总黄酮含量测定
移取10 mL待测供试品溶液于50 mL比色管中，加入10 mL去离子水，摇匀，加入1.5 mL5%的亚硝酸钠，摇匀，静置11 min，加入1.5 mL10%硝酸铝，摇匀，静置12 min后再加入10 mL4%氢氧化钠溶液，摇匀静置20 min后在510 nm及参比波长处测定其吸光度，根据差值建立标准曲线并计算总黄酮浓度然后进一步计算总黄酮含量。计算公式：
式中，W为总黄酮含量（%），C为总黄酮浓度（μg·mL-1），V2为稀释定容体积（mL），V1为取样体积（mL），V0为提取液总体积（mL），M为供试样品质量（g），两个1 000分别表示μg到mg及mg到g的换算系数，100则表示100 g样品中总黄酮的含量。
1.4 改进样品测定方法
样品测定方法包括供试样品溶液的全波长扫描、筛选和建立双波长检测模型及验证拟合检测结果等。以下是操作步骤。1）供试样品溶液的全波长扫描。分别吸取之前备好的供试品溶液在比色皿中，润洗1～3次后加入比色皿中，利用紫外分光光度仪在检测波长510 nm和参比波长450 nm处进行测定并分别记录下其吸光度。2）筛选和建立双波长检测模型。通过全波长扫描图谱，分析其供试样品的峰值及可能存在干扰的峰谷值，并通过△OD来筛选和建立双波长检测模型。其中，△OD=OD510 nm-OD450 nm，通过扣除干扰，从而对检测项目进行测定和计算。3）验证拟合检测结果。通过测定6份不同批次供试材料样品，对拟合检测结果进行统计，初步验证和评价拟合模型的科学性程度。
2 结果与分析
经过对各个供试样品的全波长扫描结果进行解析，发现其总黄酮扫描的峰值出现在（500±4）nm，而（450±4）nm处存在一峰谷值，与主峰OD500 nm的峰值存在明显叠加。分析表明这种吸光值的叠加，极有可能是造成冬青总黄酮含量测定干扰的主因。经过△OD（OD500 nm-OD450 nm）双波长拟合扣除干扰后，测定6份冬青叶供试材料的总黄酮含量，其总黄酮的含量最低为2.24%，最高为2.60%，6份样本的平均值为2.21%～2.55%。
在课题组预实验时发现，通过铝盐单波长比色法测得冬青叶总黄酮含量高于文献中报道（其总黄酮均低于3%）1倍以上，可能是冬青叶中的其他成分在总黄酮的检测中，由吸光度叠加引起的。而通过△OD（OD500 nm-OD450 nm）双波长拟合扣除干扰后，能够较好地测定冬青叶中总黄酮的含量，初步表明该双波长检测方法适用于检测冬青叶中的总黄酮含量[7]。
3 结语
冬青叶总黄酮测定中的杂质消除、总黄酮中主要黄酮类物质的提取工艺及高纯度冬青葉中的黄酮类单体的制备也是后续研究工作的一部分。冬青叶中总黄酮测定的铝盐双波长比色法，实现了冬青叶中总黄酮含量的科学、快捷检测，为冬青叶中总黄酮资源的研究和开发提供了理论基础和实践参考。
参考文献：
[1] 中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1999.
[2] 俞祥生，王强.冬青属植物叶成分分析[J].中国药科大学学报，1992，6（2）：26-28.
[3] 陈卫琳，程再兴，陈红，等.正交设计优选毛冬青总黄酮提取工艺[J].辽宁中医药大学学报，2011，13（10）：62-63.
[4] 田建平，李娟玲，胡远艳，等.冬青属苦丁茶叶总黄酮含量测定与资源评价[J].食品科技，2014，39（1）：278-281.
[5] 刘亚倩，魏华，李贵，等.荠菜总黄酮质量分数测定及超声波提取工艺优化[J].吉首大学学报，2016，37（1）：74-79.
[6] 张兰杰，辛广，张维华.双波长分光光度法测定黑玉米花粉中总黄酮的含量[J].食品科学，2006，27（2）：230-232.
[7] 刘谨，丁平.冬青属药用植物资源、化学成分及药理作用研究进展[J].广州中医药大学学报，2008，25（3）：277-280.
（责任编辑：刘昀）
关键词 冬青;总黄酮;含量测定;铝盐双波长比色法
中图分类号：R284.1 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.06.067
冬青（Ilex chinensis Sims）为冬青科Aquifoliaceae冬青属Ilex多年生植物，我国主产于安徽省、江西省、浙江省、两湖两广等江南各省，一般生长于海拔500～1 000 m
的山坡常绿阔叶林中和林缘地带。冬青属植物多用于清热解毒、消炎、镇咳祛痰及治疗心血管疾病。冬青的根、种子、树皮均可入药，其叶有清热利湿、消肿镇痛之功效，用于肺炎、急性咽喉炎症、痢疾、胆道感染、外治烧伤、下肢溃疡、皮炎湿疹、脚手皮裂等[1-3]。现代医学研究表明，黄酮类是冬青主要活性成分之一，其具有明显的降压降脂、抗菌消炎及抗肿瘤等药理功能。在对冬青叶中总黄酮含量进行测定时，发现其直接测定结果偏高;与文献报道冬青叶总黄酮的含量存在较大差异（一般<3%）。基于此，拟采用双波长等方法对冬青叶中总黄酮含量测定体系进行研究，以优化和改进总黄酮含量测定体系。
1 材料与方法
实验仪器主要有超纯水制备系统（P20-Y，长沙源科仪），电子天平（1/100 000，AG285，METTLE TOLEDO），紫外可见分光光度仪（UV2550，岛津），超声波提取器（昆山市超声提取有限公司），万能高速粉碎机（天津市斯泰勒仪器有限公司）。实验试剂包括芦丁标准样品（融禾公司生产）及以下为分析纯试剂：乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠;实验用水为超纯水。实验材料冬青叶于60 ℃恒温干燥，粉碎，过70目筛，装袋备用。
实验方法主要参考刘亚倩等[4-6]研究者进行芦丁标准曲线的制备、冬青总黄酮供试品溶液的提取富集、总黄酮含量的检测等步骤，并在此基础上改进冬青叶总黄酮检测方法。具体步骤如下。
1.1 标准曲线的制备
准确移取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、15.0 mL的0.2 mg·mL-1芦丁标准溶液，分别置于50 mL比色管中，加1.50 mL5.0%亚硝酸钠溶液，摇匀后静置11 min，加入1.50 mL10.0%硝酸铝溶液，摇匀，静置12 min后加入10 mL4.0%氢氧化钠溶液，摇匀，静置20 min，于510 nm及参比波长450 nm处测定其吸光值，记录下不同浓度吸光值。运用Excel等软件，以浓度为X轴，吸光值差值为Y轴绘制标准曲线方程Y=0.017X-0.000 8，Y吸光度，X为浓度，R2=0.999 3，在（0，39.29]μg·mL-1检测范围内符合该方程
1.2 供试品溶液的制备
准确称取0.250 g冬青样品于50 mL容量瓶中，用60%乙醇20 mL超声提取30 min后取出定容，过滤，滤液即为待测供试品溶液。
1.3 总黄酮含量测定
移取10 mL待测供试品溶液于50 mL比色管中，加入10 mL去离子水，摇匀，加入1.5 mL5%的亚硝酸钠，摇匀，静置11 min，加入1.5 mL10%硝酸铝，摇匀，静置12 min后再加入10 mL4%氢氧化钠溶液，摇匀静置20 min后在510 nm及参比波长处测定其吸光度，根据差值建立标准曲线并计算总黄酮浓度然后进一步计算总黄酮含量。计算公式：
式中，W为总黄酮含量（%），C为总黄酮浓度（μg·mL-1），V2为稀释定容体积（mL），V1为取样体积（mL），V0为提取液总体积（mL），M为供试样品质量（g），两个1 000分别表示μg到mg及mg到g的换算系数，100则表示100 g样品中总黄酮的含量。
1.4 改进样品测定方法
样品测定方法包括供试样品溶液的全波长扫描、筛选和建立双波长检测模型及验证拟合检测结果等。以下是操作步骤。1）供试样品溶液的全波长扫描。分别吸取之前备好的供试品溶液在比色皿中，润洗1～3次后加入比色皿中，利用紫外分光光度仪在检测波长510 nm和参比波长450 nm处进行测定并分别记录下其吸光度。2）筛选和建立双波长检测模型。通过全波长扫描图谱，分析其供试样品的峰值及可能存在干扰的峰谷值，并通过△OD来筛选和建立双波长检测模型。其中，△OD=OD510 nm-OD450 nm，通过扣除干扰，从而对检测项目进行测定和计算。3）验证拟合检测结果。通过测定6份不同批次供试材料样品，对拟合检测结果进行统计，初步验证和评价拟合模型的科学性程度。
2 结果与分析
经过对各个供试样品的全波长扫描结果进行解析，发现其总黄酮扫描的峰值出现在（500±4）nm，而（450±4）nm处存在一峰谷值，与主峰OD500 nm的峰值存在明显叠加。分析表明这种吸光值的叠加，极有可能是造成冬青总黄酮含量测定干扰的主因。经过△OD（OD500 nm-OD450 nm）双波长拟合扣除干扰后，测定6份冬青叶供试材料的总黄酮含量，其总黄酮的含量最低为2.24%，最高为2.60%，6份样本的平均值为2.21%～2.55%。
在课题组预实验时发现，通过铝盐单波长比色法测得冬青叶总黄酮含量高于文献中报道（其总黄酮均低于3%）1倍以上，可能是冬青叶中的其他成分在总黄酮的检测中，由吸光度叠加引起的。而通过△OD（OD500 nm-OD450 nm）双波长拟合扣除干扰后，能够较好地测定冬青叶中总黄酮的含量，初步表明该双波长检测方法适用于检测冬青叶中的总黄酮含量[7]。
3 结语
冬青叶总黄酮测定中的杂质消除、总黄酮中主要黄酮类物质的提取工艺及高纯度冬青葉中的黄酮类单体的制备也是后续研究工作的一部分。冬青叶中总黄酮测定的铝盐双波长比色法，实现了冬青叶中总黄酮含量的科学、快捷检测，为冬青叶中总黄酮资源的研究和开发提供了理论基础和实践参考。
参考文献：
[1] 中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1999.
[2] 俞祥生，王强.冬青属植物叶成分分析[J].中国药科大学学报，1992，6（2）：26-28.
[3] 陈卫琳，程再兴，陈红，等.正交设计优选毛冬青总黄酮提取工艺[J].辽宁中医药大学学报，2011，13（10）：62-63.
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[5] 刘亚倩，魏华，李贵，等.荠菜总黄酮质量分数测定及超声波提取工艺优化[J].吉首大学学报，2016，37（1）：74-79.
[6] 张兰杰，辛广，张维华.双波长分光光度法测定黑玉米花粉中总黄酮的含量[J].食品科学，2006，27（2）：230-232.
[7] 刘谨，丁平.冬青属药用植物资源、化学成分及药理作用研究进展[J].广州中医药大学学报，2008，25（3）：277-280.
（责任编辑：刘昀）