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[摘要] 目的 觀察低能量体外冲击波（ESW）对膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡的影响。 方法 将30只裸大鼠按随机数字表法分为空白组（n=10）、模型组（n=10）、低能量ESW组（n=10）；模型组与低能量ESW组均建立KOA模型，空白组不予以建模；建模6周后，拆除石膏，低能量ESW组予以低能量（0.1 mJ/mm2）ESW治疗，冲击1000次。4周后，处死大鼠，行组织形态大体观察及染色观察，并采用TENUL方法对软骨细胞凋亡情况进行检测。结果 干预4周末，空白组软骨外观显光亮蓝白色，无裂痕、缺损，软骨结构、潮线显示清楚；模型组膝关节呈现典型的KOA病理改变；而低能量ESW组软骨触摸有软化，少许脱落，潮线模糊。低能量ESW组Moran评分为（5.93±0.71）分，明显高于模型组的（4.32±0.76）分（P<0.05）；低能量ESW组Mankin评分、细胞凋亡率分别为（8.03±1.07）分、（12.12±1.59）%，均明显低于模型组的（9.78±1.76）分、（14.25±2.23）%，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 低能量ESW可有效抑制KOA大鼠软骨细胞凋亡，对KOA治疗有重要参考价值。
[关键词] 低能量体外冲击波；膝骨关节炎；软骨细胞；凋亡
[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）01-0032-04
Effects of low energy extracorporeal shock wave on chondrocytes apoptosis in rats with knee osteoarthritis
GAO Hongliang ZHOU Xinhua WU Meng LI Jianyou
Department of Orthopedics，Huzhou Central Hospital in Zhejiang Province， Huzhou 313003，China
[Abstract] Objective To observe the effects of low energy extracorporeal shock wave（ESW） on chondrocyte apoptosis in rats with knee osteoarthritis. Methods The 30 nude rats were divided into the blank group（n=10），the model group （n=10） and the low energy ESW group（n=10） by random number table method. The model group and the low energy ESW group were given the establishment of the KOA model，and the blank group was not modeled. After 6 weeks of modeling，the plaster was removed and the low energy ESW group was treated with low-energy（0.1 mJ/mm2） ESW with 1000 shocks. After 4 weeks，the rats were killed and the morphological observation and staining observation were carried out. The chondrocytes apoptosis was detected by TENUL. Results At the end of 4 week of intervention，there were bright blue cartilages without cracks and defects，and the clear cartilage structure and tidal line in the blank group. The typical KOA pathological changes were shown in the knee joint in the model group while the cartilage touch was softened with a little fell off，and the tidal line was blurred in the low energy ESW group. The score of Moran in the low energy ESW group was significantly higher than that in the model group[（5.93±0.71） points vs （4.32±0.76） points] （P<0.05）. The Mankin score and chondrocyte apoptosis rate were significantly lower than those in the model group [（8.03±1.07） points vs （9.78±1.76） points； （12.12±1.59）% vs （14.25±2.23）%] （P<0.05）. Conclusion Low energy ESW can effectively inhibit the chondrocytes apoptosis in KOA rats，and has important reference value for the treatment of KOA. [Key words] Low energy extracorporeal shock wave； Knee osteoarthritis； Chondrocytes； Apoptosis
膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是老年人常见病、多发病，在60岁以上人群中，男性、女性发病率分别为9.6%、18%[1]。目前KOA治疗目的在于缓解患者疼痛等症状，但这些治疗均无法有效阻止病情进展，患者最终需采取全膝人工关节置换术进行治疗[2，3]。软骨退变、损伤是KOA的基本病理改变，通过抑制软骨细胞凋亡阻止疾病发展是一种治疗新思路。目前关于促进软骨缺损细胞修复的研究较多，但临床始终缺乏改善软骨损伤并取得理想远期疗效的治疗手段。体外冲击波（extracorporeal shock wave，ESW）是在运动医学领域兴起的一种非侵入性治疗方法，针对不同疾病可采取不同能量治疗[4]。由于治疗时，关节软骨常暴露于冲击波范围，冲击波对关节软骨的影响亦引起人们重视。动物研究表明，ESW对骨性关节炎（OA）有较好的疗效，可有效减轻关节疼痛，并改善关节功能[5]。然而，关于ESW治疗OA的远期疗效仍缺乏深入研究。本研究旨在观察低能量ESW对膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡的影响，现报道如下。
1 材料与方法
1.1实验动物
SPF级雄性裸大鼠30只，体质量150～220 g，月龄4～6个月，由北京维通利华实验动物有限责任公司提供，动物编号：SCXK（沪）2015-0002；饲养于我院动物中心实验室SPF环境中，温度（24±2）℃，湿度30%～60%，常规自由饮食，每天日照12 h，通风良好。实验时对实验动物的处理方式符合动物伦理要求。
1.2实验试剂
苏木精购自美国Sigma-Aldrich，伊红（水溶）购自上海抚生生物科技有限公司，甲苯胺蓝购自北京华越洋生物科技有限公司，DAB显色试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司，细胞凋亡检测试剂盒均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，AB-PAS结肠黏膜染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，山羊抗鼠IgG抗体-HRP多聚体、抗体稀释液购自辽宁迈迪生物科技股份有限公司，DAB浓缩加强型试剂盒购自北京泰泽瑞达科技有限公司，甲醛、盐酸、双氧水、二甲苯、EDTA、75%乙醇、中性树胶、PBS（自配）均为国家分析纯。
1.3方法
1.3.1分组 2016年12月在我院OA研究重点实验室进行实验，对裸鼠进行编号并采用随机数字表法分为三组，即空白组、模型组、ESW组，每组10只。
1.3.2建立模型 模型组与ESW组KOA模型均以改良伸直位固定法进行建立：采用棉垫对鼠左后肢固定区域进行包裹，接着采用管状石膏予以固定，范围由股骨上端到小腿关节上1 cm，待石膏硬化后，将鼠放回鼠笼，行单笼饲养。空白组不予以建模。
1.3.3干预 建模6周后，行石膏拆除，ESW组予以低能量（0.1 mJ/mm2）ESW治疗1次，冲击1000次。其他两组不予以干预。
1.3.4关节取材 于干预后4周行空气栓塞法，将大鼠处死，打开大鼠关节腔，明确踝关节软骨部位后，采用锋利刀片将其取出，并以10%甲醛溶液进行固定，24 h后置于混合酸脱钙液中脱钙10 d。之后经脱水、透明、浸蜡、包埋等过程，制作石蜡标本，并切成石蜡切片，厚度约为5 μm。依次行免疫组化法、苏木精-伊红染色法（HE）、AB-PAS染色液及甲苯胺蓝染色，并应用TUNEL法对细胞凋亡情况进行检测。
1.4观察指标
1.4.1组织形态 （1）肉眼下对软骨面情况进行观察，包括关节黏连、软骨表面修复与腐蚀、外观等情况，行Moran评分[6]，具体评分标准如下：Ⅰ关节黏连，无（2分）、小而且疏松的纤维组织（1分）、大而且致密的纤维组织（0分）；Ⅱ软骨表面修复情况，完全修复（2分）、部分修复（1分）、未修复（0分）；Ⅲ软骨腐蚀情况，无（2分）、缺损区域或边缘（1分）、缺损区域或邻近的正常软骨（0分）；Ⅳ软骨外观，半透明（2分）、不透明（1分）、变色或不规则（0分）。（2）HE染色、AB-PAS染色及甲苯胺蓝染色后进行观察，包括组织结构、细胞、基质着色、潮线等4个方面，行Mankin评分[6]，具体评分标准如下：Ⅰ结构，正常（0分）、表面不规则（1分）、血管翳和表面不规则（2分）、裂隙达移行层（3分）、裂隙达放射层（4分）、裂隙达钙化层（5分）、结构完全紊乱（6分）；Ⅱ细胞，正常（0分）、弥散性细胞增多（1分）、细胞形成集落（2分）、细胞过多（3分）；Ⅲ基质着色，正常（0分）、轻度减弱（1分）、中度减弱（2分）、重度减弱（3分）、完全未染色（4分）；Ⅳ潮线完整性，完整（0分）、有血管穿过（1分）。
1.4.2免疫组化法 石蜡切片作常规方法脫蜡至水，蛋白酶K（5 μg/mL），常温下15 min。采用3% H2O2甲醇，常温下孵育10 min；再加入0.1% Triton及0.1%枸橼酸钠，冰上反应2 min。加50 μL TUNEL反应液，置于37℃湿盒中孵育30 min；加50 μL POD，37℃湿盒中孵育60 min。滴入DAB显色液，显色10 min；HE染色法复染，以水洗净。以75%盐酸酒精分色，二甲苯透明，再采用中性树脂胶进行封片，显微镜下观察；光学显微镜下观察，并显微放大照相，实验时设立阳性对照及阴性对照来确保染色结果真实性，胞核显示黄色颗粒弥漫性分布，则判定为阳性（即为凋亡细胞），而被苏木精复染呈蓝色者为阴性。高倍镜视野下计数阳性（黄染）及阴性（蓝染）细胞核数，并计算细胞凋亡率；凋亡率=阳性细胞核数/（阳性细胞核数 阴性细胞核数）×100%。
1.5统计学方法
应用SPSS19.0软件处理研究数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，多组比较采用方差齐性分析；P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1建模结果
建模6周末，模型组、ESW组的KOA大鼠膝关节可见充血、肿胀明显，关节液混浊，量增多，软骨处有溃疡与裂隙，滑膜充血、水肿明显。
2.2大体观察结果
大鼠关节腔开启后显示：（1）空白组，软骨外观显光亮蓝白色，无裂痕、缺损，且表面未见纤维组织覆盖；（2）模型组，关节外观无光泽，呈暗黄色，软骨触感较软，表面不光滑，有明显残损及骨赘，软骨表面有大量疏松纤维组织覆盖，表面部分修复；（3）ESW组，关节软骨呈灰白色，表面可见增生，触摸有软化，少许脱落，软骨表面有少量疏松纤维组织覆盖，表面部分修复（封三图1）。模型组与低能量ESW组Moran评分较空白组均明显降低（P<0.05），而低能量ESW组较模型组Moran评分显著升高（P<0.05）。见表1。
2.3染色结果
（1）空白组：软骨外表光滑，表层梭形细胞排列整齐有序，中间层圆形细胞散在分布，柱状层细胞致密排列，软骨结构、潮线显示清楚，基质染色未见消退。（2）模型组：软骨变薄，细胞数目减少，排序紊乱，基质染色显著消退，潮线不全。（3）低能量ESW组：软骨变薄，细胞排序紊乱，基质染色有所减退，潮线稍显模糊。见封三图2～4。Mankin评分比较上，模型组、低能量ESW组均明显高于空白组（P<0.05），而低能量ESW组显著低于模型组（P<0.05）。见表1。
2.4软骨细胞凋亡情况
空白组仅存在少许凋亡的软骨细胞，而模型组与低能量ESW组较空白组凋亡细胞数目明显多见。见封三图5。软骨细胞凋亡率比较上，模型组与低能量ESW组均明显高于空白组（P<0.05），而低能量ESW组明显低于模型组（P<0.05）。见表1。
3 讨论
随着人口老龄化不断加剧，KOA已成为影响老年人日常生活能力的关键因素之一[7]。调查发现，在躯体疼痛、社会功能、心理健康等多个因素作用下，KOA患者生存质量明显降低[8]。KOA症状表现早期主要为活动不适或可感疼痛，随着疾病进展，活动时疼痛逐渐突出，并转变为胀痛，甚至出现关节肿胀、活动受限、肌肉萎缩等一系列症状。既往研究认为，KOA发病机制在于软骨降解及关节边缘骨赘生成，而近年众多证据显示，软骨细胞退化及凋亡与KOA发生发展密切相关[9-11]。软骨细胞在软骨损伤、修复中发挥着重要作用。有研究[12]通过对比正常人群与KOA患者软骨细胞发现，KOA患者较正常人软骨细胞凋亡数目明显增多，且软骨细胞凋亡数目与KOA病情严重程度呈正相关，提示通过抑制软骨细胞凋亡可能成为KOA治疗的新思路。
近年研究发现，采用ESW治疗OA可有效缓解疼痛症状。Revenaugh[13]对OA马模型予以ESW治疗，发现治疗后疼痛指数明显减轻，认为ESW经麻木周围神经使得痛觉缺失，改善软骨水肿而发挥缓解疼痛作用。Mattheolabakis等[14]通过采用ESW治疗，使大鼠步行距离明显改善，进一步指出其作用机制可能是下调降钙素基因作用的坐骨神经元受体，从而抑制痛觉产生。Souza等[15]发现，ESW可通过降低关节液中前列腺素E2水平而改善狗髋关节OA症状。Mcilwraith等[16]研究表明，ESW治疗可有效减轻马腕OA疼痛症状，并可能是通过减少关节内P物质合成而实现的。
根据冲击波的能流密度可将ESW分为低、中、高三级，一般认为能流密度≥0.5 mJ/mm2为高能量ESW，能流密度≤0.1 mJ/mm2为低能量ESW。低能量ESW被认为安全性较高，不会对软骨细胞产生毒害[17]。本研究采用低能量ESW治疗后，实验大鼠膝关节无红肿、瘀斑等症状出现，表明低能量ESW安全性较高。但在采用高能量ESW治疗时需谨慎，原因在于有研究发现采用能流密度为0.5 mJ/mm2的ESW治疗后第4周大鼠OA膝关节出现部分软骨细胞坏死的现象[18]。
关于ESW对延缓OA进展的机制至今仍未明确。目前认为，ESW发挥OA治疗可能与促进血管再生、多种因子分泌、提高软骨细胞增殖活性等多种因素有关[19，20]。实验证实软骨细胞对ESW具有较高敏感性，相关机制可能是通过一系列分子信号的级联反应，达到调控细胞生长、分裂、蛋白质合成的目的。本研究采用TUNEL检测软骨细胞凋亡情况，结果显示，干预4周末模型组膝关节呈现典型的KOA病理改变，而低能量ESW组轻于模型组。进一步分析发现，低能量ESW组较模型组软骨细胞凋亡率明显降低，表明ESW可有效抑制软骨细胞凋亡，从而延缓大鼠KOA的进展。
综上所述，低能量ESW对大鼠KOA关节软骨凋亡有抑制作用，延缓KOA进展。低能量ESW有望成为治疗KOA的重要途径，值得深入研究。
[参考文献]
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[13] Revenaugh MS. Extracorporeal shock wave therapy for treatment of osteoarthritis in the horse：Clinical applications[J].Veterinary Clinics of North America Equine Practice，2005，21（3）：609-625.
[14] Mattheolabakis G，Mackenzie GG，Huang L，et al. Topically applied phospho-sulindac hydrogel is efficacious and safe in the treatment of experimental arthritis in rats[J]. Pharmaceutical Research，2013，30（6）：1471-1482.
[15] Souza ANA，Ferreira MP，Hagen SCF，et al. Radial shock wave therapy in dogs with hip osteoarthritis[J]. Veterinary
[关键词] 低能量体外冲击波；膝骨关节炎；软骨细胞；凋亡
[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）01-0032-04
Effects of low energy extracorporeal shock wave on chondrocytes apoptosis in rats with knee osteoarthritis
GAO Hongliang ZHOU Xinhua WU Meng LI Jianyou
Department of Orthopedics，Huzhou Central Hospital in Zhejiang Province， Huzhou 313003，China
[Abstract] Objective To observe the effects of low energy extracorporeal shock wave（ESW） on chondrocyte apoptosis in rats with knee osteoarthritis. Methods The 30 nude rats were divided into the blank group（n=10），the model group （n=10） and the low energy ESW group（n=10） by random number table method. The model group and the low energy ESW group were given the establishment of the KOA model，and the blank group was not modeled. After 6 weeks of modeling，the plaster was removed and the low energy ESW group was treated with low-energy（0.1 mJ/mm2） ESW with 1000 shocks. After 4 weeks，the rats were killed and the morphological observation and staining observation were carried out. The chondrocytes apoptosis was detected by TENUL. Results At the end of 4 week of intervention，there were bright blue cartilages without cracks and defects，and the clear cartilage structure and tidal line in the blank group. The typical KOA pathological changes were shown in the knee joint in the model group while the cartilage touch was softened with a little fell off，and the tidal line was blurred in the low energy ESW group. The score of Moran in the low energy ESW group was significantly higher than that in the model group[（5.93±0.71） points vs （4.32±0.76） points] （P<0.05）. The Mankin score and chondrocyte apoptosis rate were significantly lower than those in the model group [（8.03±1.07） points vs （9.78±1.76） points； （12.12±1.59）% vs （14.25±2.23）%] （P<0.05）. Conclusion Low energy ESW can effectively inhibit the chondrocytes apoptosis in KOA rats，and has important reference value for the treatment of KOA. [Key words] Low energy extracorporeal shock wave； Knee osteoarthritis； Chondrocytes； Apoptosis
膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是老年人常见病、多发病，在60岁以上人群中，男性、女性发病率分别为9.6%、18%[1]。目前KOA治疗目的在于缓解患者疼痛等症状，但这些治疗均无法有效阻止病情进展，患者最终需采取全膝人工关节置换术进行治疗[2，3]。软骨退变、损伤是KOA的基本病理改变，通过抑制软骨细胞凋亡阻止疾病发展是一种治疗新思路。目前关于促进软骨缺损细胞修复的研究较多，但临床始终缺乏改善软骨损伤并取得理想远期疗效的治疗手段。体外冲击波（extracorporeal shock wave，ESW）是在运动医学领域兴起的一种非侵入性治疗方法，针对不同疾病可采取不同能量治疗[4]。由于治疗时，关节软骨常暴露于冲击波范围，冲击波对关节软骨的影响亦引起人们重视。动物研究表明，ESW对骨性关节炎（OA）有较好的疗效，可有效减轻关节疼痛，并改善关节功能[5]。然而，关于ESW治疗OA的远期疗效仍缺乏深入研究。本研究旨在观察低能量ESW对膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡的影响，现报道如下。
1 材料与方法
1.1实验动物
SPF级雄性裸大鼠30只，体质量150～220 g，月龄4～6个月，由北京维通利华实验动物有限责任公司提供，动物编号：SCXK（沪）2015-0002；饲养于我院动物中心实验室SPF环境中，温度（24±2）℃，湿度30%～60%，常规自由饮食，每天日照12 h，通风良好。实验时对实验动物的处理方式符合动物伦理要求。
1.2实验试剂
苏木精购自美国Sigma-Aldrich，伊红（水溶）购自上海抚生生物科技有限公司，甲苯胺蓝购自北京华越洋生物科技有限公司，DAB显色试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司，细胞凋亡检测试剂盒均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，AB-PAS结肠黏膜染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，山羊抗鼠IgG抗体-HRP多聚体、抗体稀释液购自辽宁迈迪生物科技股份有限公司，DAB浓缩加强型试剂盒购自北京泰泽瑞达科技有限公司，甲醛、盐酸、双氧水、二甲苯、EDTA、75%乙醇、中性树胶、PBS（自配）均为国家分析纯。
1.3方法
1.3.1分组 2016年12月在我院OA研究重点实验室进行实验，对裸鼠进行编号并采用随机数字表法分为三组，即空白组、模型组、ESW组，每组10只。
1.3.2建立模型 模型组与ESW组KOA模型均以改良伸直位固定法进行建立：采用棉垫对鼠左后肢固定区域进行包裹，接着采用管状石膏予以固定，范围由股骨上端到小腿关节上1 cm，待石膏硬化后，将鼠放回鼠笼，行单笼饲养。空白组不予以建模。
1.3.3干预 建模6周后，行石膏拆除，ESW组予以低能量（0.1 mJ/mm2）ESW治疗1次，冲击1000次。其他两组不予以干预。
1.3.4关节取材 于干预后4周行空气栓塞法，将大鼠处死，打开大鼠关节腔，明确踝关节软骨部位后，采用锋利刀片将其取出，并以10%甲醛溶液进行固定，24 h后置于混合酸脱钙液中脱钙10 d。之后经脱水、透明、浸蜡、包埋等过程，制作石蜡标本，并切成石蜡切片，厚度约为5 μm。依次行免疫组化法、苏木精-伊红染色法（HE）、AB-PAS染色液及甲苯胺蓝染色，并应用TUNEL法对细胞凋亡情况进行检测。
1.4观察指标
1.4.1组织形态 （1）肉眼下对软骨面情况进行观察，包括关节黏连、软骨表面修复与腐蚀、外观等情况，行Moran评分[6]，具体评分标准如下：Ⅰ关节黏连，无（2分）、小而且疏松的纤维组织（1分）、大而且致密的纤维组织（0分）；Ⅱ软骨表面修复情况，完全修复（2分）、部分修复（1分）、未修复（0分）；Ⅲ软骨腐蚀情况，无（2分）、缺损区域或边缘（1分）、缺损区域或邻近的正常软骨（0分）；Ⅳ软骨外观，半透明（2分）、不透明（1分）、变色或不规则（0分）。（2）HE染色、AB-PAS染色及甲苯胺蓝染色后进行观察，包括组织结构、细胞、基质着色、潮线等4个方面，行Mankin评分[6]，具体评分标准如下：Ⅰ结构，正常（0分）、表面不规则（1分）、血管翳和表面不规则（2分）、裂隙达移行层（3分）、裂隙达放射层（4分）、裂隙达钙化层（5分）、结构完全紊乱（6分）；Ⅱ细胞，正常（0分）、弥散性细胞增多（1分）、细胞形成集落（2分）、细胞过多（3分）；Ⅲ基质着色，正常（0分）、轻度减弱（1分）、中度减弱（2分）、重度减弱（3分）、完全未染色（4分）；Ⅳ潮线完整性，完整（0分）、有血管穿过（1分）。
1.4.2免疫组化法 石蜡切片作常规方法脫蜡至水，蛋白酶K（5 μg/mL），常温下15 min。采用3% H2O2甲醇，常温下孵育10 min；再加入0.1% Triton及0.1%枸橼酸钠，冰上反应2 min。加50 μL TUNEL反应液，置于37℃湿盒中孵育30 min；加50 μL POD，37℃湿盒中孵育60 min。滴入DAB显色液，显色10 min；HE染色法复染，以水洗净。以75%盐酸酒精分色，二甲苯透明，再采用中性树脂胶进行封片，显微镜下观察；光学显微镜下观察，并显微放大照相，实验时设立阳性对照及阴性对照来确保染色结果真实性，胞核显示黄色颗粒弥漫性分布，则判定为阳性（即为凋亡细胞），而被苏木精复染呈蓝色者为阴性。高倍镜视野下计数阳性（黄染）及阴性（蓝染）细胞核数，并计算细胞凋亡率；凋亡率=阳性细胞核数/（阳性细胞核数 阴性细胞核数）×100%。
1.5统计学方法
应用SPSS19.0软件处理研究数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，多组比较采用方差齐性分析；P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1建模结果
建模6周末，模型组、ESW组的KOA大鼠膝关节可见充血、肿胀明显，关节液混浊，量增多，软骨处有溃疡与裂隙，滑膜充血、水肿明显。
2.2大体观察结果
大鼠关节腔开启后显示：（1）空白组，软骨外观显光亮蓝白色，无裂痕、缺损，且表面未见纤维组织覆盖；（2）模型组，关节外观无光泽，呈暗黄色，软骨触感较软，表面不光滑，有明显残损及骨赘，软骨表面有大量疏松纤维组织覆盖，表面部分修复；（3）ESW组，关节软骨呈灰白色，表面可见增生，触摸有软化，少许脱落，软骨表面有少量疏松纤维组织覆盖，表面部分修复（封三图1）。模型组与低能量ESW组Moran评分较空白组均明显降低（P<0.05），而低能量ESW组较模型组Moran评分显著升高（P<0.05）。见表1。
2.3染色结果
（1）空白组：软骨外表光滑，表层梭形细胞排列整齐有序，中间层圆形细胞散在分布，柱状层细胞致密排列，软骨结构、潮线显示清楚，基质染色未见消退。（2）模型组：软骨变薄，细胞数目减少，排序紊乱，基质染色显著消退，潮线不全。（3）低能量ESW组：软骨变薄，细胞排序紊乱，基质染色有所减退，潮线稍显模糊。见封三图2～4。Mankin评分比较上，模型组、低能量ESW组均明显高于空白组（P<0.05），而低能量ESW组显著低于模型组（P<0.05）。见表1。
2.4软骨细胞凋亡情况
空白组仅存在少许凋亡的软骨细胞，而模型组与低能量ESW组较空白组凋亡细胞数目明显多见。见封三图5。软骨细胞凋亡率比较上，模型组与低能量ESW组均明显高于空白组（P<0.05），而低能量ESW组明显低于模型组（P<0.05）。见表1。
3 讨论
随着人口老龄化不断加剧，KOA已成为影响老年人日常生活能力的关键因素之一[7]。调查发现，在躯体疼痛、社会功能、心理健康等多个因素作用下，KOA患者生存质量明显降低[8]。KOA症状表现早期主要为活动不适或可感疼痛，随着疾病进展，活动时疼痛逐渐突出，并转变为胀痛，甚至出现关节肿胀、活动受限、肌肉萎缩等一系列症状。既往研究认为，KOA发病机制在于软骨降解及关节边缘骨赘生成，而近年众多证据显示，软骨细胞退化及凋亡与KOA发生发展密切相关[9-11]。软骨细胞在软骨损伤、修复中发挥着重要作用。有研究[12]通过对比正常人群与KOA患者软骨细胞发现，KOA患者较正常人软骨细胞凋亡数目明显增多，且软骨细胞凋亡数目与KOA病情严重程度呈正相关，提示通过抑制软骨细胞凋亡可能成为KOA治疗的新思路。
近年研究发现，采用ESW治疗OA可有效缓解疼痛症状。Revenaugh[13]对OA马模型予以ESW治疗，发现治疗后疼痛指数明显减轻，认为ESW经麻木周围神经使得痛觉缺失，改善软骨水肿而发挥缓解疼痛作用。Mattheolabakis等[14]通过采用ESW治疗，使大鼠步行距离明显改善，进一步指出其作用机制可能是下调降钙素基因作用的坐骨神经元受体，从而抑制痛觉产生。Souza等[15]发现，ESW可通过降低关节液中前列腺素E2水平而改善狗髋关节OA症状。Mcilwraith等[16]研究表明，ESW治疗可有效减轻马腕OA疼痛症状，并可能是通过减少关节内P物质合成而实现的。
根据冲击波的能流密度可将ESW分为低、中、高三级，一般认为能流密度≥0.5 mJ/mm2为高能量ESW，能流密度≤0.1 mJ/mm2为低能量ESW。低能量ESW被认为安全性较高，不会对软骨细胞产生毒害[17]。本研究采用低能量ESW治疗后，实验大鼠膝关节无红肿、瘀斑等症状出现，表明低能量ESW安全性较高。但在采用高能量ESW治疗时需谨慎，原因在于有研究发现采用能流密度为0.5 mJ/mm2的ESW治疗后第4周大鼠OA膝关节出现部分软骨细胞坏死的现象[18]。
关于ESW对延缓OA进展的机制至今仍未明确。目前认为，ESW发挥OA治疗可能与促进血管再生、多种因子分泌、提高软骨细胞增殖活性等多种因素有关[19，20]。实验证实软骨细胞对ESW具有较高敏感性，相关机制可能是通过一系列分子信号的级联反应，达到调控细胞生长、分裂、蛋白质合成的目的。本研究采用TUNEL检测软骨细胞凋亡情况，结果显示，干预4周末模型组膝关节呈现典型的KOA病理改变，而低能量ESW组轻于模型组。进一步分析发现，低能量ESW组较模型组软骨细胞凋亡率明显降低，表明ESW可有效抑制软骨细胞凋亡，从而延缓大鼠KOA的进展。
综上所述，低能量ESW对大鼠KOA关节软骨凋亡有抑制作用，延缓KOA进展。低能量ESW有望成为治疗KOA的重要途径，值得深入研究。
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