【摘 要】
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试验旨在构建非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)EP153R基因原核表达系统,表达EP153R重组蛋白(rEP153R),并制备抗rEP153R的多克隆抗体.根据ASFV Georgia 2007/1的
【机 构】
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中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193
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试验旨在构建非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)EP153R基因原核表达系统,表达EP153R重组蛋白(rEP153R),并制备抗rEP153R的多克隆抗体.根据ASFV Georgia 2007/1的EP153R基因序列(Gen-Bank登录号:FR682468.1)合成EP153R基因序列,并将其插入pET-28a载体,构建pET-28a-EP153R重组质粒,经双酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,分别在16和37℃条件下经IPTG诱导12 h进行最适诱导温度筛选.在最适温度下进行重组蛋白的表达,并利用SDS-PAGE、Western blotting进行初步鉴定.切取SDS-PAGE蛋白胶25 ku处条带,利用液相色谱一质谱联用技术鉴定重组蛋白是否正确表达.用纯化的rEP153R免疫小鼠,制备抗rEP153R的多克隆抗体,通过间接ELISA检测其抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性.结果 显示,重组菌在16℃表达量较高,并以包涵体形式表达,产物在25 ku处出现明显的条带,与预期蛋白大小相符,表明rEP153R成功表达.液相色谱一质谱联用技术鉴定结果显示,匹配到YIGLINK、NESV-LLR和KYIGLINK 3个rEP153R的特异性肽段,证实该蛋白为rEP153R.间接ELISA检测多克隆抗体效价为1∶128 000;Western blotting结果显示,制备的抗体具有较好的特异性.以上结果表明本研究成功表达了rEP153R,并制备了其特异性抗体,为进一步研究该蛋白生物学功能、非洲猪瘟活载体疫苗鉴定等提供了技术支持和材料.
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