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[摘要] 目的 探讨细胞角蛋白CK19 mRNA表达水平在乳腺癌微转移检测及治疗监测中的应用。方法 选择我院2004年2月～2011年8月健康体检者30例作为对照组，同时选择良性乳腺肿瘤30例，乳腺癌30例，对健康体检者、30例良性乳腺肿瘤和30例乳腺癌患者进行外周血中CK19 mRNA水平检查，统计比较组间的差异。结果 CK19 mRNA在乳腺癌组表达明显高于良性乳腺疾病组，乳腺癌淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论 FQ-PCR检测CK19 mRNA对乳腺癌诊断特异性较高，具有确切的预测价值，可有效监测乳腺癌微转移和疗效，临床值得推广。
[关键词] 乳腺癌微转移；CK19 mRNA；预测
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）21-0022-02
CK19作为上皮组织来源的组织特异性指标，近年来研究发现CK19的异常表达与乳腺癌的微转移及其疗效具有密切关系[1-3]。FQ-PCR可以进行核酸定量分析，灵敏性高、特异性高，具有同时进行扩增和检测的双重优势，诊断乳腺癌微转移具有一定的临床应用价值，引起人们的广泛关注。选择我院2004年2月～2011年8月健康体检者30例作为对照组，同时选择良性乳腺肿瘤患者30例，乳腺癌患者30例，对健康体检者、30例良性乳腺肿瘤患者和30例乳腺癌患者进行外周血中CK19 mRNA水平检查，统计比较组之间的差异，现总结报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择我院2004年2月～2011年8月健康体检者30例作为对照组，同时选择良性乳腺肿瘤患者30例，乳腺癌患者30例，对健康体检者、30例良性乳腺肿瘤患者和30例乳腺癌患者进行外周血中CK19 mRNA水平检查，统计比较组间的差别。入选者均心、肺、肝、肾等功能健全；30例乳腺癌患者均经病理确诊。两组间患者年龄比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。
1.2方法
术前1周内取晨血5 mL，为抗凝加少量的EDTA(1 mg/mL)，生理盐水稀释2倍，借助淋巴细胞分离液将淋巴细胞分离完全，提取细胞总RNA[3]。并设计CK19的引物和探针。逆转录反应体系50 μL，在分析仪上对标本、阳性对照、阴性对照和标准品进行扩增和分析。采用Bieche的标准曲线制备方法，线性范围：（1 022～1 066）/mL。仪器根据标准曲线自动计算出标本中CK19的拷贝数/ mL，定量分析GAPDH的拷贝数/mL，CK19/GAPDH比值。
1.3统计学方法
数据使用SPSS17.0统计学软件，多组间计量资料比较采用方差分析,两两比较进行t检验,计数资料采用卡方检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1对照组与疾病组CK19测定结果
表1可见，CK19在乳腺癌组明显高于良性乳腺疾病组（P < 0.05）；CK19/GAPDH在乳腺癌组明显高于良性乳腺疾病组（P < 0.05）；GAPDH组间差异不明显。
表1 对照组与疾病组CK19测定结果（x±s）
注：乳腺癌组与良性乳腺疾病组比较具有统计学意义（▲P ＜0.05）
2.2比较FQ-PCR和RT-PCR用于乳腺癌微转移诊断的评价
我们比较了RT-PCR法和FQ-PCR两种方法检测乳腺癌灵敏度，表明FQ-PCR对乳腺癌诊断的灵敏度、特异性显著高于RT-PCR法（P < 0.05）。见表2。
表2 两种方法对乳腺癌灵敏度、特异性比较
注：两组比较具有统计学意义（▲P ＜0.05）
3 讨论
近年来分子生物学广泛应用，现代医学认为角蛋白19是一种酸性蛋白[4-6]。CK19在正常上皮和各种上皮来源的肿瘤中，均会有表达，但是在正常情况下，外周血、骨髓、淋巴结内不会表达。CK19在甲状腺癌、肝胆管细胞癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌等均有不同程度的表达，特别是在肺鳞状细胞癌中的诊断、监测、预后起重要作用。如果外周血中检测发现有CK19 mRNA，表明肿瘤细胞已经进入血液，说明肿瘤转移。目前在临床上已肯定CK19 mRNA表达水平在乳腺癌诊断及治疗监测中的应用价值[7,8]。
本研究结果显示，CK19在乳腺癌组明显高于良性乳腺疾病组，CK19/GAPDH在乳腺癌组明显高于良性乳腺疾病组（P < 0.05），GAPDH组间差异没有明显差异（P ＞ 0.05）；表明CK19 mRNA表达水平明显减弱。我们比较了RT-PCR法和FQ-PCR两种方法检测结果，表明FQ-PCR对乳腺癌诊断的灵敏度显著高于RT-PCR法。
综上所述，CK19的基因表达水平可有效监测乳腺癌微转移和疗效，FQ-PCR法不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的作用，可以获得定量的结果，所以FQ-PCR还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，结果更加可靠，检验更加方便。可以有效地用于乳腺癌检测。健康人与乳腺癌微转移患者之间CK19的基因表达水平具有明显差异；同时，外周血CK19 mRNA的表达水平，为临床判断乳腺癌血行转移的高危险因素的患者提供参考指标，也为患者的个体化治疗提供依据。我们认为CK19 mRNA表达水平对预测乳腺癌微转移具有重要价值，值得推广应用。
[参考文献]
[1] Kao T J，Isaacson D，Newell J C，et al． A 3D reconstruction algorithm for EIT using a handheld probe for breast cancer detection[J]． Physiological Measurement，2006，27（5）：1-11． [2] 沈坤炜，Nirmal Lamichhane，韩企夏，等． 乳腺癌前哨淋巴结活检[J]． 中华外科杂志，2002，40（5）：247-350．
[3] Oh TI，Lee J，Seo JK，et al． Feasibility of breast cancer lesion detection using a multi-frequency trans-admittance scanner（TAS） with 10 Hz to 500 kHz bandwidth[J]． Physiological Measurement，2007，28（7）：71-84．
[4] 付峰，董秀珍，刘锐岗，等． 乳腺电阻抗投影成像算法及实现[J]． 中国生物医学工程学报，2008，27（5）：659-662．
[5] 徐昊，陈创，刘春梅，等． 阿达玛变换光谱显微成像分析乳腺癌组织肿瘤标志物的分布[J]． 光谱学与光谱分析，2009，29（12）：3217-3219．
[6] 王侃，董秀珍，付峰，等． 基于电阻抗扫描的乳腺组织阻抗频谱特性测量实验[J]． 生物物理学报，2008，24（6）：474-480．
[7] Ironstone J，Graovac M，Martens J，et al． Novel lead configurations for robust bio·impedanceacquisition[C]． Proceedings of the 29th Annual International Conference of the 1EEE EMBS[J]. Lyon，France，2007：2764-2767．
[8] Stojadinovic A，Nissan A，Gallimidi Z，et al． Electricalimpedance scanning for the early detection of breastcancer in young women：preliminary results of a multicenter prospective clinical trial[J]． Journal of Clinical Oncology，2005，23（12）：2703-2715．
（收稿日期：2012-05-14）
[关键词] 乳腺癌微转移；CK19 mRNA；预测
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）21-0022-02
CK19作为上皮组织来源的组织特异性指标，近年来研究发现CK19的异常表达与乳腺癌的微转移及其疗效具有密切关系[1-3]。FQ-PCR可以进行核酸定量分析，灵敏性高、特异性高，具有同时进行扩增和检测的双重优势，诊断乳腺癌微转移具有一定的临床应用价值，引起人们的广泛关注。选择我院2004年2月～2011年8月健康体检者30例作为对照组，同时选择良性乳腺肿瘤患者30例，乳腺癌患者30例，对健康体检者、30例良性乳腺肿瘤患者和30例乳腺癌患者进行外周血中CK19 mRNA水平检查，统计比较组之间的差异，现总结报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择我院2004年2月～2011年8月健康体检者30例作为对照组，同时选择良性乳腺肿瘤患者30例，乳腺癌患者30例，对健康体检者、30例良性乳腺肿瘤患者和30例乳腺癌患者进行外周血中CK19 mRNA水平检查，统计比较组间的差别。入选者均心、肺、肝、肾等功能健全；30例乳腺癌患者均经病理确诊。两组间患者年龄比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。
1.2方法
术前1周内取晨血5 mL，为抗凝加少量的EDTA(1 mg/mL)，生理盐水稀释2倍，借助淋巴细胞分离液将淋巴细胞分离完全，提取细胞总RNA[3]。并设计CK19的引物和探针。逆转录反应体系50 μL，在分析仪上对标本、阳性对照、阴性对照和标准品进行扩增和分析。采用Bieche的标准曲线制备方法，线性范围：（1 022～1 066）/mL。仪器根据标准曲线自动计算出标本中CK19的拷贝数/ mL，定量分析GAPDH的拷贝数/mL，CK19/GAPDH比值。
1.3统计学方法
数据使用SPSS17.0统计学软件，多组间计量资料比较采用方差分析,两两比较进行t检验,计数资料采用卡方检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1对照组与疾病组CK19测定结果
表1可见，CK19在乳腺癌组明显高于良性乳腺疾病组（P < 0.05）；CK19/GAPDH在乳腺癌组明显高于良性乳腺疾病组（P < 0.05）；GAPDH组间差异不明显。
表1 对照组与疾病组CK19测定结果（x±s）
注：乳腺癌组与良性乳腺疾病组比较具有统计学意义（▲P ＜0.05）
2.2比较FQ-PCR和RT-PCR用于乳腺癌微转移诊断的评价
我们比较了RT-PCR法和FQ-PCR两种方法检测乳腺癌灵敏度，表明FQ-PCR对乳腺癌诊断的灵敏度、特异性显著高于RT-PCR法（P < 0.05）。见表2。
表2 两种方法对乳腺癌灵敏度、特异性比较
注：两组比较具有统计学意义（▲P ＜0.05）
3 讨论
近年来分子生物学广泛应用，现代医学认为角蛋白19是一种酸性蛋白[4-6]。CK19在正常上皮和各种上皮来源的肿瘤中，均会有表达，但是在正常情况下，外周血、骨髓、淋巴结内不会表达。CK19在甲状腺癌、肝胆管细胞癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌等均有不同程度的表达，特别是在肺鳞状细胞癌中的诊断、监测、预后起重要作用。如果外周血中检测发现有CK19 mRNA，表明肿瘤细胞已经进入血液，说明肿瘤转移。目前在临床上已肯定CK19 mRNA表达水平在乳腺癌诊断及治疗监测中的应用价值[7,8]。
本研究结果显示，CK19在乳腺癌组明显高于良性乳腺疾病组，CK19/GAPDH在乳腺癌组明显高于良性乳腺疾病组（P < 0.05），GAPDH组间差异没有明显差异（P ＞ 0.05）；表明CK19 mRNA表达水平明显减弱。我们比较了RT-PCR法和FQ-PCR两种方法检测结果，表明FQ-PCR对乳腺癌诊断的灵敏度显著高于RT-PCR法。
综上所述，CK19的基因表达水平可有效监测乳腺癌微转移和疗效，FQ-PCR法不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的作用，可以获得定量的结果，所以FQ-PCR还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，结果更加可靠，检验更加方便。可以有效地用于乳腺癌检测。健康人与乳腺癌微转移患者之间CK19的基因表达水平具有明显差异；同时，外周血CK19 mRNA的表达水平，为临床判断乳腺癌血行转移的高危险因素的患者提供参考指标，也为患者的个体化治疗提供依据。我们认为CK19 mRNA表达水平对预测乳腺癌微转移具有重要价值，值得推广应用。
[参考文献]
[1] Kao T J，Isaacson D，Newell J C，et al． A 3D reconstruction algorithm for EIT using a handheld probe for breast cancer detection[J]． Physiological Measurement，2006，27（5）：1-11． [2] 沈坤炜，Nirmal Lamichhane，韩企夏，等． 乳腺癌前哨淋巴结活检[J]． 中华外科杂志，2002，40（5）：247-350．
[3] Oh TI，Lee J，Seo JK，et al． Feasibility of breast cancer lesion detection using a multi-frequency trans-admittance scanner（TAS） with 10 Hz to 500 kHz bandwidth[J]． Physiological Measurement，2007，28（7）：71-84．
[4] 付峰，董秀珍，刘锐岗，等． 乳腺电阻抗投影成像算法及实现[J]． 中国生物医学工程学报，2008，27（5）：659-662．
[5] 徐昊，陈创，刘春梅，等． 阿达玛变换光谱显微成像分析乳腺癌组织肿瘤标志物的分布[J]． 光谱学与光谱分析，2009，29（12）：3217-3219．
[6] 王侃，董秀珍，付峰，等． 基于电阻抗扫描的乳腺组织阻抗频谱特性测量实验[J]． 生物物理学报，2008，24（6）：474-480．
[7] Ironstone J，Graovac M，Martens J，et al． Novel lead configurations for robust bio·impedanceacquisition[C]． Proceedings of the 29th Annual International Conference of the 1EEE EMBS[J]. Lyon，France，2007：2764-2767．
[8] Stojadinovic A，Nissan A，Gallimidi Z，et al． Electricalimpedance scanning for the early detection of breastcancer in young women：preliminary results of a multicenter prospective clinical trial[J]． Journal of Clinical Oncology，2005，23（12）：2703-2715．
（收稿日期：2012-05-14）