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摘 要：该文以太湖县野生水芹腋芽为试验材料，探讨了不同消毒时间和激素浓度对野生水芹组织培养的影响。结果表明：野生水芹腋芽为外植体的最适消毒时间为8min。最适诱导培养基为MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.25mg·L-1，其腋芽增殖率最高为92.3%；转入生根培养基MS+NAA0.5mg·L-1的第60天时，生根率为100%；移栽后，成活率达98%以上。
关键词：太湖县；野生水芹；再生体系
中图分类号 S688 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）01-0043-03
Abstract：The experiment investigated the effect of different sterilize time and hormone content on tissue culture of Oenanthe stolonifera D.C，with the axillary shoots as experimental material.The results showed that the optimum sterilize time of axillary shoots is 8min. The best medium of axillary shoots induction is MS+6-BA1. 0mg·L-1+NAA0.25mg·L-1，it's axillary shoots induction is 92.3%，which is the highest；in the medium of rooting which is MS+NAA0.5mg·L-1，and 60 days later the rooting rate is 100%，the survival rate after transplantation is above 98%.
Key words：Taihu County；Wild Oenanthe stolonifera D.C.；Regeneration system
水芹（Oenanthe stolonifera D.C.，2n=2x=22），又名野芹菜、水芹菜、溝芹菜、小叶芹、河芹、马芹、刀芹、蜀芹、水英、楚葵、紫堇等[1-2]，属伞形花科水芹属多年宿根草本植物，多为湿生或水生[3-4]。水芹在我国栽培和食用的历史悠久，野生水芹属于高产水生蔬菜，富含蛋白质、维生素、无机盐类、挥发油、钙、磷、铁、镁等，嫩茎和叶柄均可食用，味道鲜美并带有不太强烈的特殊中药味。全株均可入药，其味甘辛，性凉，具有清热解毒、降低血糖、降血压、明目利水、预防肺癌等药用功效，能治疗多种疾病[5]，是食药同源的无公害水生草本蔬菜，深受广大消费者的青睐。
水芹多为花而不实或种子发育不良，采收较难，生产上一般采用分株繁殖，但需种量大，繁殖系数低，且长期无性繁殖可导致种性退化，从而制约了水芹栽培面积的扩大和产量的提高，导致部分地区产量大幅度下降[6]。同时，由于过度的采收，野生资源破坏严重，致使野生水芹形成种子具有一定的难度，自然条件下不易进行繁殖，其分布区域和数量逐年减少，无法满足人们栽培的需求[7]。因此，对野生水芹进行组织培养并建立无性系，以期对野生资源进行保护，同时可为野生水芹的工厂化生产提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料 新鲜野生水芹（Oenanthe stolonifera D.C.）取自安徽省太湖县；MS干粉、蔗糖、琼脂粉；6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）等。
1.2 试验设计
1.2.1 外植体消毒 将野生水芹用试管刷在流水下刷洗干净后，置于流水下冲洗12h，之后在超净台上将野生水芹腋芽用小刀片切下，置于无菌小烧杯中，先加入75%乙醇消毒30s后，再用2.5% NaClO分别消毒4、5、6、7、8、9min，之后用无菌水冲洗4次，每次3min，获得无菌材料。将水芹腋芽接种于诱导培养基（1～5）中，观察消毒时间对野生水芹腋芽出芽率、污染率和褐化率的影响。其中，每瓶接4个腋芽，每个处理8瓶，3次重复，每2～3d观察一次，记录并统计结果。在明确最适消毒时间后，将水芹腋芽分别接种于1～5号诱导培养基中，观察腋芽增殖情况并确定最适诱导培养基。待腋芽增殖为丛生芽后，计算增殖率并转入6号生根培养基中，统计5、10、15、25、35、45、60d野生水芹的生根率，其中，增殖率（%）=（增殖后的丛芽数-增殖前的丛芽数/增殖后的丛芽数）×100，生根率（%）=（生根的外植体/接种外植体总数）×100。
1.2.2 培养基和培养条件 诱导培养基：（1）MS+
6-BA 2.0mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1，（2）MS+6-BA 1.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1，（3）MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1，（4）MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.25mg·L-1，（5）MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1，生根培养基：（6）MS+NAA 0.5mg·L-1。上述培养基中含有30g·L-1蔗糖，0.8%琼脂粉（6号培养基除外），pH5.8。接种材料培养温度为（25±1）℃，诱导期间采用暗培养，增殖和生根培养为光周期12/12h·d-1，光照强度为25μmol·m-2·s-1，相对湿度为（65±10）%的条件下进行。
1.3 数据统计分析 采用DPS数据处理系统进行方差分析；用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 消毒时间对野生水芹丛生芽诱导的影响 将野生水芹腋芽接种于1～5号诱导培养基中，7d以后腋芽开始萌动（图1、2）。由表1可见，随着消毒时间的延长，野生水芹的平均出芽率呈现先下降后上升再下降的变化趋势，在消毒时间为8min时，平均出芽率达到最大值，为25.04%，与消毒时间为4min、5min、6min、7min和9min时的平均出芽率之间表现为极显著差异（P<0.01）；平均污染率呈现先下降后上升的变化趋势，在消毒时间为8min时，平均污染率最低，为5.96%，此时平均褐化率与消毒时间为9min之间无显著差异（P>0.05），而平均死亡率也是最低，为45.11%，随着消毒时间的进一步延长，平均死亡率呈现增加的趋势。综合比较得出，野生水芹的最适消毒时间为8min。 2.2 激素浓度对野生水芹丛生芽增殖的影响 由图3可见，在NAA浓度保持为0.5mg·L-1不变的条件下，随着6-BA浓度的降低（1、2和3号培养基），野生水芹的叢生芽增殖率呈现逐渐升高的趋势，最高增殖率为80.5%；在6-BA浓度保持为1.0mg·L-1不变的条件下，随着NAA浓度的升高（4、3和5号培养基），野生水芹的丛生芽增殖率呈现逐渐下降的趋势，最高增殖率为92.3%。综合比较得出，野生水芹丛生芽增殖的适宜培养基为4号培养基：MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.25mg·L-1。
2.3 野生水芹试管苗的生根培养 将增殖后的野生水芹转入6号生根培养基进行生根培养，由表2可见，随着野生水芹生根培养时间的延长，根的颜色呈现淡绿白色-绿白色-淡绿色-绿色的形态变化，平均主根长、平均根数和平均生根率都变现为逐渐增加的变化趋势，在生根培养的第60d时，平均生根率达到100%且根系较发达（图4），为下一步的炼苗移栽奠定了基础。
2.4 野生水芹试管苗炼苗和移栽 将野生水芹试管苗在培养室内打开瓶盖先进行7d环境适应性锻炼，再将水芹苗从培养瓶中取出，用清水冲洗根部的培养基，置于装有清水的平托盘中进行炼苗（图5）。炼苗期间每2～3d换一次清水，炼苗时间为21d。炼苗结束后，于晴天上午将野生水芹苗移栽至有肥沃园土的泥池中，浇透水，保持湿度为95%以上，15d后移栽成活率达98%以上（图6）。
3 讨论与结论
在组织培养过程中，外植体的选择、消毒时间以及激素浓度的配比是组织培养成败的关键因素。野生水芹由于其特殊的生长环境，表面带有大量杂菌以及材料内部携带有内生菌。除由于无菌操作不当引起的污染外，另一种可能就是由内生菌引起的污染，有研究发现[8]，观赏水草采取连续多代高温加剥茎尖培养的方法能有效控制材料内生菌的污染。本试验以野生水芹的腋芽为外植体诱导形成丛生芽，并增殖、生根、炼苗及移栽，建立了野生水芹再生体系，得出野生水芹腋芽的最佳消毒时间为8min，水芹腋芽增殖的最适培养基为MS+6
-BA1.0mg·L-1+NAA0.25mg·L-1，增殖率为92.3%，试管苗在MS+NAA0.5mg·L-1液体培养基上生根效果较好，在第60d时生根率达到100%，移栽后，成活率达98%以上，这些可为野生水芹的工厂化种苗生产提供技术基础。此外，利用植物组织培养技术可以解决野生水芹种质资源稀缺、繁殖过程受季节制约等问题，为野生资源的保护提供了一条途径，同时也为水芹优良品种的选育提供技术基础。
参考文献
[1]谷业理.水芹芽优质高效栽培技术[J].上海蔬菜，2013（1）：26-27，61.
[2]赵有为.中国水生蔬菜[M].北京：中国农业出版社，1999.
[3]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第五十五卷（第二分册）[M].北京：科学出版社，1992：202.
[4]李书心.辽宁植物志（上册）[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，1988：1326-1327.
[5]郑汉臣.中国食用本草（植物卷）[M].上海：上海辞书出版社，2003：251-252.
[6]赵书花.水芹种质资源亲缘关系分析[D].扬州：扬州大学，2010.
[7]许文一，高洋，马依妮，等.水芹的组织培养及快速繁殖研究[J].安徽农业科学，2008，36（14）：5761-5762，5800.
[8]孙月芳，陆瑞菊，周润梅，等.观赏水草的离体培养[J].上海农业学报，2004，20（2）：17-19.
（责编：张宏民）
关键词：太湖县；野生水芹；再生体系
中图分类号 S688 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）01-0043-03
Abstract：The experiment investigated the effect of different sterilize time and hormone content on tissue culture of Oenanthe stolonifera D.C，with the axillary shoots as experimental material.The results showed that the optimum sterilize time of axillary shoots is 8min. The best medium of axillary shoots induction is MS+6-BA1. 0mg·L-1+NAA0.25mg·L-1，it's axillary shoots induction is 92.3%，which is the highest；in the medium of rooting which is MS+NAA0.5mg·L-1，and 60 days later the rooting rate is 100%，the survival rate after transplantation is above 98%.
Key words：Taihu County；Wild Oenanthe stolonifera D.C.；Regeneration system
水芹（Oenanthe stolonifera D.C.，2n=2x=22），又名野芹菜、水芹菜、溝芹菜、小叶芹、河芹、马芹、刀芹、蜀芹、水英、楚葵、紫堇等[1-2]，属伞形花科水芹属多年宿根草本植物，多为湿生或水生[3-4]。水芹在我国栽培和食用的历史悠久，野生水芹属于高产水生蔬菜，富含蛋白质、维生素、无机盐类、挥发油、钙、磷、铁、镁等，嫩茎和叶柄均可食用，味道鲜美并带有不太强烈的特殊中药味。全株均可入药，其味甘辛，性凉，具有清热解毒、降低血糖、降血压、明目利水、预防肺癌等药用功效，能治疗多种疾病[5]，是食药同源的无公害水生草本蔬菜，深受广大消费者的青睐。
水芹多为花而不实或种子发育不良，采收较难，生产上一般采用分株繁殖，但需种量大，繁殖系数低，且长期无性繁殖可导致种性退化，从而制约了水芹栽培面积的扩大和产量的提高，导致部分地区产量大幅度下降[6]。同时，由于过度的采收，野生资源破坏严重，致使野生水芹形成种子具有一定的难度，自然条件下不易进行繁殖，其分布区域和数量逐年减少，无法满足人们栽培的需求[7]。因此，对野生水芹进行组织培养并建立无性系，以期对野生资源进行保护，同时可为野生水芹的工厂化生产提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料 新鲜野生水芹（Oenanthe stolonifera D.C.）取自安徽省太湖县；MS干粉、蔗糖、琼脂粉；6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）等。
1.2 试验设计
1.2.1 外植体消毒 将野生水芹用试管刷在流水下刷洗干净后，置于流水下冲洗12h，之后在超净台上将野生水芹腋芽用小刀片切下，置于无菌小烧杯中，先加入75%乙醇消毒30s后，再用2.5% NaClO分别消毒4、5、6、7、8、9min，之后用无菌水冲洗4次，每次3min，获得无菌材料。将水芹腋芽接种于诱导培养基（1～5）中，观察消毒时间对野生水芹腋芽出芽率、污染率和褐化率的影响。其中，每瓶接4个腋芽，每个处理8瓶，3次重复，每2～3d观察一次，记录并统计结果。在明确最适消毒时间后，将水芹腋芽分别接种于1～5号诱导培养基中，观察腋芽增殖情况并确定最适诱导培养基。待腋芽增殖为丛生芽后，计算增殖率并转入6号生根培养基中，统计5、10、15、25、35、45、60d野生水芹的生根率，其中，增殖率（%）=（增殖后的丛芽数-增殖前的丛芽数/增殖后的丛芽数）×100，生根率（%）=（生根的外植体/接种外植体总数）×100。
1.2.2 培养基和培养条件 诱导培养基：（1）MS+
6-BA 2.0mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1，（2）MS+6-BA 1.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1，（3）MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1，（4）MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.25mg·L-1，（5）MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1，生根培养基：（6）MS+NAA 0.5mg·L-1。上述培养基中含有30g·L-1蔗糖，0.8%琼脂粉（6号培养基除外），pH5.8。接种材料培养温度为（25±1）℃，诱导期间采用暗培养，增殖和生根培养为光周期12/12h·d-1，光照强度为25μmol·m-2·s-1，相对湿度为（65±10）%的条件下进行。
1.3 数据统计分析 采用DPS数据处理系统进行方差分析；用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 消毒时间对野生水芹丛生芽诱导的影响 将野生水芹腋芽接种于1～5号诱导培养基中，7d以后腋芽开始萌动（图1、2）。由表1可见，随着消毒时间的延长，野生水芹的平均出芽率呈现先下降后上升再下降的变化趋势，在消毒时间为8min时，平均出芽率达到最大值，为25.04%，与消毒时间为4min、5min、6min、7min和9min时的平均出芽率之间表现为极显著差异（P<0.01）；平均污染率呈现先下降后上升的变化趋势，在消毒时间为8min时，平均污染率最低，为5.96%，此时平均褐化率与消毒时间为9min之间无显著差异（P>0.05），而平均死亡率也是最低，为45.11%，随着消毒时间的进一步延长，平均死亡率呈现增加的趋势。综合比较得出，野生水芹的最适消毒时间为8min。 2.2 激素浓度对野生水芹丛生芽增殖的影响 由图3可见，在NAA浓度保持为0.5mg·L-1不变的条件下，随着6-BA浓度的降低（1、2和3号培养基），野生水芹的叢生芽增殖率呈现逐渐升高的趋势，最高增殖率为80.5%；在6-BA浓度保持为1.0mg·L-1不变的条件下，随着NAA浓度的升高（4、3和5号培养基），野生水芹的丛生芽增殖率呈现逐渐下降的趋势，最高增殖率为92.3%。综合比较得出，野生水芹丛生芽增殖的适宜培养基为4号培养基：MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.25mg·L-1。
2.3 野生水芹试管苗的生根培养 将增殖后的野生水芹转入6号生根培养基进行生根培养，由表2可见，随着野生水芹生根培养时间的延长，根的颜色呈现淡绿白色-绿白色-淡绿色-绿色的形态变化，平均主根长、平均根数和平均生根率都变现为逐渐增加的变化趋势，在生根培养的第60d时，平均生根率达到100%且根系较发达（图4），为下一步的炼苗移栽奠定了基础。
2.4 野生水芹试管苗炼苗和移栽 将野生水芹试管苗在培养室内打开瓶盖先进行7d环境适应性锻炼，再将水芹苗从培养瓶中取出，用清水冲洗根部的培养基，置于装有清水的平托盘中进行炼苗（图5）。炼苗期间每2～3d换一次清水，炼苗时间为21d。炼苗结束后，于晴天上午将野生水芹苗移栽至有肥沃园土的泥池中，浇透水，保持湿度为95%以上，15d后移栽成活率达98%以上（图6）。
3 讨论与结论
在组织培养过程中，外植体的选择、消毒时间以及激素浓度的配比是组织培养成败的关键因素。野生水芹由于其特殊的生长环境，表面带有大量杂菌以及材料内部携带有内生菌。除由于无菌操作不当引起的污染外，另一种可能就是由内生菌引起的污染，有研究发现[8]，观赏水草采取连续多代高温加剥茎尖培养的方法能有效控制材料内生菌的污染。本试验以野生水芹的腋芽为外植体诱导形成丛生芽，并增殖、生根、炼苗及移栽，建立了野生水芹再生体系，得出野生水芹腋芽的最佳消毒时间为8min，水芹腋芽增殖的最适培养基为MS+6
-BA1.0mg·L-1+NAA0.25mg·L-1，增殖率为92.3%，试管苗在MS+NAA0.5mg·L-1液体培养基上生根效果较好，在第60d时生根率达到100%，移栽后，成活率达98%以上，这些可为野生水芹的工厂化种苗生产提供技术基础。此外，利用植物组织培养技术可以解决野生水芹种质资源稀缺、繁殖过程受季节制约等问题，为野生资源的保护提供了一条途径，同时也为水芹优良品种的选育提供技术基础。
参考文献
[1]谷业理.水芹芽优质高效栽培技术[J].上海蔬菜，2013（1）：26-27，61.
[2]赵有为.中国水生蔬菜[M].北京：中国农业出版社，1999.
[3]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第五十五卷（第二分册）[M].北京：科学出版社，1992：202.
[4]李书心.辽宁植物志（上册）[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，1988：1326-1327.
[5]郑汉臣.中国食用本草（植物卷）[M].上海：上海辞书出版社，2003：251-252.
[6]赵书花.水芹种质资源亲缘关系分析[D].扬州：扬州大学，2010.
[7]许文一，高洋，马依妮，等.水芹的组织培养及快速繁殖研究[J].安徽农业科学，2008，36（14）：5761-5762，5800.
[8]孙月芳，陆瑞菊，周润梅，等.观赏水草的离体培养[J].上海农业学报，2004，20（2）：17-19.
（责编：张宏民）