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摘要：通过1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin与coldplasma复合诱变Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株，再利用分离筛选获得总溶剂产量与三株丁醇都有较为显著提高的突变菌株，突变菌株发酵10%木薯醪液之后总溶剂产量与丁醇分别达到20.79g/L、20.14g/L、20.36g/L与12.74g/L、12.44g/L、12.59g/L，与出发菌株相比较分别提高了15.4%-19.1%、21.6%-24.5%。优化编号414的突变菌株的发酵条件，在100mL的三角瓶发酵体系里面，编号为414的突变菌株的最佳发酵条件为接种量10%，种龄为24h，ph值控制在7左右，装液量为100mL，然后在37℃温度环境下静置发酵72h，在这个发酵条件之下，此菌株发酵7%木薯醪液产总溶剂量与丁醇分别达到了26-30g/L，17-19g/L。
关键词：丙酮丁醇高产菌株、选育、优化、研究
现今全球对石油资源的需求量越来越大及其价格持续攀升，很多国家都已着手开展重大的战略转向，利用生物资源替代石油资源，放弃化学技术战略，通过生物技术战略生产生物燃料以替代越来越少的石油资源。丁醇作为新开发的生物燃料，可以大量掺入石油，与燃料乙醇相比较在经济性方面也就具有更大的优势。本论文通过长期研究中获得Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株，Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株突破了以往仅能利用Clostridiumsp.（专性厌氧梭状芽孢杆菌）的局限，为研究生产丁醇奠定了基础。本论文通过1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin与coldplasma复合诱变选育Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株，且采取有效措施优化Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株的发酵条件，进而有效提升了丁醇发酵的产量，对于丁醇大批量的工业生产具有指导性意义。
1材料与方法
1.1菌种
在实验室中从种植怀地黄的土壤中筛选、分离、保存得到Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株。
1.2培养基
1.2.1分离纯化培养基
1000mL蒸馏水，20g/L琼脂，30g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，0.01g/L氯化钠，0.2g/L硫酸镁，0.01g/L七水合硫酸亚铁，0.5g/L磷酸氢二钾，0.5g/L磷酸二氢钾。
1.2.2活化培养基
制作10%的木薯醪液：将少许水加入木薯粉中，慢慢调制成糊状，再将调好的木薯糊缓缓倒入沸水中，一边倒一边搅拌，煮15-20min。然后再将制作好的活化培养基装入试管之中，经过15min121℃的灭菌。
1.2.3发酵培养基
利用制作活化培养基的方式配置10%的木薯醪液作为发酵培养基。
1.2.4P2培养基
储备溶液10mL/L，0.1L/g酵母浸膏，30g/L葡萄糖。
1.3菌种活化
取木薯醪试管菌种，在木薯醪试管培养基中接种10%的接种量，通过一百摄氏度水中浴热处理六十至九十秒之后又用冷水急速冷却，之后在三十七摄氏度的环境下静置培养24h。
1.4利用1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin与coldplasma复合诱变菌种
把通过10%的木薯醪液活化的Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株接种到18mm×180mm的p2试管培养基10mL中，三十七摄氏度培养24h达到对数生长期之后，在0.5mL的反应铁片上涂0.5mL的菌液，之后在把涂好菌液的反应铁片放在距离离子发射孔1-2mm的位置，利用60v、120w的离子发射90s之后，在反应铁片用2mL无菌生理盐水洗涤，然后在10%的木薯醪液中接种进处理好的菌液活化，活化好之后根据10%的接种量放入p2培养基中，在37℃的条件下培养24h之后获得的菌体用每分钟五千转的速度离心5min，用缓冲液离心洗涤菌体四次，再将菌体悬浮在体积相同的磷酸盐缓冲液之中。之后在含有16mL每升的分离纯化培养基平板上涂布通过以上操作的菌液，在37℃的条件下培养2-3天。在10%的木薯醪液中接入从分离纯化培养基平板上挑选出来的较大饱满的菌落，之后发酵筛选出的优良的菌株。
1.5丁醇发酵筛选
菌种经10%的木薯醪液活化24h后，按10%接种量接种入发酵培养基（100mL三角瓶，装液量100mL）中，37℃静置发酵27h。发酵结束后，取2mL发酵液，每分钟12000转速离心10min，取上清液保存于-20℃冰箱中，待测其中丙酮、丁醇和乙醇（总溶剂，ABE）的含量。
1.6发酵条件优化
在100mL的三角瓶发酵体系（总容积约150mL，装液量100mL）中，按1.5发酵条件，分别对初始pH值、种龄、接种量和发酵时间进行发酵条件优化研究。
1.7溶剂含量测定
高效气相色谱法：Agilent7890A气相色谱仪，进样量0.2μL，进样口温度为200℃，分流比30∶1，氮气流量每分钟1.5mL，柱箱温度60摄氏度，保持时间4min，检测器（FID）温度250℃。
2结果与分析
2.1诱变育种结果
将出发菌株经低温等离子体和亚硝基胍复合诱变后涂布分离筛选平板（培养基中含16mL/L丁醇作为选择压力），挑取长势良好的菌落接种入10%木薯醪液中连续传代培养（10代以上），选择木薯醪液液化良好的菌株进行发酵筛选，结果见表1。其中菌株213、42和414丁醇和总溶剂产量分别达到12.59g/L、12.44g/L、12.74g/L和20.36g/L、20.14g/L、20.79g/L，较出发菌株丁醇和总溶剂产量分别提高了21.6%～23.1%和15.4%～19.4%。
表1丁醇产生菌株复合诱变發酵筛选结果
2.2培养基初始pH值对发酵的影响
在100mL的三角瓶发酵体系中，装液量100mL、种龄24小时、接种量10%、发酵温度37℃、发酵时间72h，调整发酵培养基的初始pH值分别为5、6、7、8、9的5个梯度，考察发酵培养基初始pH值对丁醇发酵的影响。结果（图1）表明，当培养基的初始pH值为7时，丁醇和总溶剂的产量最高，分别达到12.78g/L和21.54g/L。木薯醪液的初始pH值为7左右，因此发酵培养基不必调整pH值（图1）。
3结论
利用低温等离子体和亚硝基胍（NTG）对丁醇发酵芽孢杆菌C2菌株进行复合诱变，通过平板分离、连续传代培养、液体发酵筛选等过程，得到多株丁醇产量明显提高的突变菌株，其中编号为213、42和414的突变菌株发酵10%木薯醪液后丁醇和总溶剂产量分别为12.59g/L、12.44g/L、12.74g/L和20.36g/L、20.14g/L、20.79g/L，分别比出发菌株C2提高23.1%、21.6%、24.5%和16.7%、15.4%、19.1%。对414号菌株的发酵条件进行优化，在100mL三角瓶发酵体系中，该菌株的最适发酵条件为：装液量100mL，种龄24h，接种量10%，pH值为7（自然），37℃静置发酵72h，在此条件下，414菌株发酵7%木薯醪液产丁醇和总溶剂量分别为17-19g/L和26-30g/L。
参考文献
[1]陈陶声，陆祖祺.发酵法丙酮和丁醇生产技术[M].北京：化学工业出版杜，1991.
[2]沈佩芝，任诚.丁醇、辛醇生产技术与市场需求预测[J].化工进展，2005，24（2）：216-220.
[3]王风芹，谢慧，楚乐然等.产丁醇芽孢杆菌的分离、筛选与鉴定[J].微生物学通报，2010，37（2）：7-11.
[4]陈陶声，陆祖祺.发酵法丙酮和丁醇生产技术[M].北京：化学工业出版杜，1991.
关键词：丙酮丁醇高产菌株、选育、优化、研究
现今全球对石油资源的需求量越来越大及其价格持续攀升，很多国家都已着手开展重大的战略转向，利用生物资源替代石油资源，放弃化学技术战略，通过生物技术战略生产生物燃料以替代越来越少的石油资源。丁醇作为新开发的生物燃料，可以大量掺入石油，与燃料乙醇相比较在经济性方面也就具有更大的优势。本论文通过长期研究中获得Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株，Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株突破了以往仅能利用Clostridiumsp.（专性厌氧梭状芽孢杆菌）的局限，为研究生产丁醇奠定了基础。本论文通过1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin与coldplasma复合诱变选育Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株，且采取有效措施优化Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株的发酵条件，进而有效提升了丁醇发酵的产量，对于丁醇大批量的工业生产具有指导性意义。
1材料与方法
1.1菌种
在实验室中从种植怀地黄的土壤中筛选、分离、保存得到Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株。
1.2培养基
1.2.1分离纯化培养基
1000mL蒸馏水，20g/L琼脂，30g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，0.01g/L氯化钠，0.2g/L硫酸镁，0.01g/L七水合硫酸亚铁，0.5g/L磷酸氢二钾，0.5g/L磷酸二氢钾。
1.2.2活化培养基
制作10%的木薯醪液：将少许水加入木薯粉中，慢慢调制成糊状，再将调好的木薯糊缓缓倒入沸水中，一边倒一边搅拌，煮15-20min。然后再将制作好的活化培养基装入试管之中，经过15min121℃的灭菌。
1.2.3发酵培养基
利用制作活化培养基的方式配置10%的木薯醪液作为发酵培养基。
1.2.4P2培养基
储备溶液10mL/L，0.1L/g酵母浸膏，30g/L葡萄糖。
1.3菌种活化
取木薯醪试管菌种，在木薯醪试管培养基中接种10%的接种量，通过一百摄氏度水中浴热处理六十至九十秒之后又用冷水急速冷却，之后在三十七摄氏度的环境下静置培养24h。
1.4利用1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin与coldplasma复合诱变菌种
把通过10%的木薯醪液活化的Bacillussp.（兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌）C2菌株接种到18mm×180mm的p2试管培养基10mL中，三十七摄氏度培养24h达到对数生长期之后，在0.5mL的反应铁片上涂0.5mL的菌液，之后在把涂好菌液的反应铁片放在距离离子发射孔1-2mm的位置，利用60v、120w的离子发射90s之后，在反应铁片用2mL无菌生理盐水洗涤，然后在10%的木薯醪液中接种进处理好的菌液活化，活化好之后根据10%的接种量放入p2培养基中，在37℃的条件下培养24h之后获得的菌体用每分钟五千转的速度离心5min，用缓冲液离心洗涤菌体四次，再将菌体悬浮在体积相同的磷酸盐缓冲液之中。之后在含有16mL每升的分离纯化培养基平板上涂布通过以上操作的菌液，在37℃的条件下培养2-3天。在10%的木薯醪液中接入从分离纯化培养基平板上挑选出来的较大饱满的菌落，之后发酵筛选出的优良的菌株。
1.5丁醇发酵筛选
菌种经10%的木薯醪液活化24h后，按10%接种量接种入发酵培养基（100mL三角瓶，装液量100mL）中，37℃静置发酵27h。发酵结束后，取2mL发酵液，每分钟12000转速离心10min，取上清液保存于-20℃冰箱中，待测其中丙酮、丁醇和乙醇（总溶剂，ABE）的含量。
1.6发酵条件优化
在100mL的三角瓶发酵体系（总容积约150mL，装液量100mL）中，按1.5发酵条件，分别对初始pH值、种龄、接种量和发酵时间进行发酵条件优化研究。
1.7溶剂含量测定
高效气相色谱法：Agilent7890A气相色谱仪，进样量0.2μL，进样口温度为200℃，分流比30∶1，氮气流量每分钟1.5mL，柱箱温度60摄氏度，保持时间4min，检测器（FID）温度250℃。
2结果与分析
2.1诱变育种结果
将出发菌株经低温等离子体和亚硝基胍复合诱变后涂布分离筛选平板（培养基中含16mL/L丁醇作为选择压力），挑取长势良好的菌落接种入10%木薯醪液中连续传代培养（10代以上），选择木薯醪液液化良好的菌株进行发酵筛选，结果见表1。其中菌株213、42和414丁醇和总溶剂产量分别达到12.59g/L、12.44g/L、12.74g/L和20.36g/L、20.14g/L、20.79g/L，较出发菌株丁醇和总溶剂产量分别提高了21.6%～23.1%和15.4%～19.4%。
表1丁醇产生菌株复合诱变發酵筛选结果
2.2培养基初始pH值对发酵的影响
在100mL的三角瓶发酵体系中，装液量100mL、种龄24小时、接种量10%、发酵温度37℃、发酵时间72h，调整发酵培养基的初始pH值分别为5、6、7、8、9的5个梯度，考察发酵培养基初始pH值对丁醇发酵的影响。结果（图1）表明，当培养基的初始pH值为7时，丁醇和总溶剂的产量最高，分别达到12.78g/L和21.54g/L。木薯醪液的初始pH值为7左右，因此发酵培养基不必调整pH值（图1）。
3结论
利用低温等离子体和亚硝基胍（NTG）对丁醇发酵芽孢杆菌C2菌株进行复合诱变，通过平板分离、连续传代培养、液体发酵筛选等过程，得到多株丁醇产量明显提高的突变菌株，其中编号为213、42和414的突变菌株发酵10%木薯醪液后丁醇和总溶剂产量分别为12.59g/L、12.44g/L、12.74g/L和20.36g/L、20.14g/L、20.79g/L，分别比出发菌株C2提高23.1%、21.6%、24.5%和16.7%、15.4%、19.1%。对414号菌株的发酵条件进行优化，在100mL三角瓶发酵体系中，该菌株的最适发酵条件为：装液量100mL，种龄24h，接种量10%，pH值为7（自然），37℃静置发酵72h，在此条件下，414菌株发酵7%木薯醪液产丁醇和总溶剂量分别为17-19g/L和26-30g/L。
参考文献
[1]陈陶声，陆祖祺.发酵法丙酮和丁醇生产技术[M].北京：化学工业出版杜，1991.
[2]沈佩芝，任诚.丁醇、辛醇生产技术与市场需求预测[J].化工进展，2005，24（2）：216-220.
[3]王风芹，谢慧，楚乐然等.产丁醇芽孢杆菌的分离、筛选与鉴定[J].微生物学通报，2010，37（2）：7-11.
[4]陈陶声，陆祖祺.发酵法丙酮和丁醇生产技术[M].北京：化学工业出版杜，1991.