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摘要：目的 建立痹痛灵酊中雷公藤内酯醇的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法（HPLC），Dionex Acclaim 120 C18柱，以甲醇-水（35∶65）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为218 nm。结果 HPLC测定雷公藤内酯醇，可达基线分离，雷公藤内酯醇对照品在0.019 2～0.115 2 ?g内呈线性关系，r=0.999 8，平均回收率为100.76%，RSD=1.85%（n=6）。结论 本法简便快速，结果准确，重复性好，可作为该制剂的质量控制方法。
关键词：痹痛灵酊；高效液相色谱法；雷公藤内酯醇
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）04-0051-02
痹痛灵酊为福建中医药大学附属人民医院院内外用制剂，具有祛风除湿、清热通络、消肿定痛之功效，临床用于风湿痹阻所致的关节疼痛、腰腿疼痛、屈伸不利等。方中雷公藤为君药，有祛风除湿、活血通络、消肿定痛之功，用于治疗风湿热痹痛，关节僵硬，屈伸不利，腰膝疼痛等症。近年研究发现，雷公藤内酯醇能够抑制佛波酯刺激的关节滑膜成纤维细胞白细胞介素-18及其受体表达[1]。另有文献报道，雷公藤内酯醇可抑制佐剂性关节炎大鼠病变关节组织组织型一氧化氮合酶表达从而减少病变关节组织一氧化氮含量[2]。为控制本品工艺质量，对制剂中雷公藤内酯醇成分进行了高效液相色谱法（HPLC）含量测定的研究，现报道如下。
1 仪器与试药
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适用性试验
Dionex Acclaim 120 C18色谱柱（5 ?m，4.6 mm×250 mm）；ODS预柱（美国迪马科技）；流动相：甲醇-水（35∶65）；流速：1.0 mL/min；柱温：20 ℃；检测波长：218 nm；进样量：10 ?L；理论塔板数以雷公藤内酯醇计算不低于4 000[3]。
2.2 对照品溶液的制备
取雷公藤内酯醇对照品适量，精密称定，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，制成每1 mL含雷公藤内酯醇48 ?g的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密量取本品100 mL，水浴上挥干乙醇后，加纯化水至50 mL，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次50 mL，合并提取液，回收乙酸乙酯，浓缩干少量，上中性氧化铝柱（湿法装柱，10 g，100～200目），用乙酸乙酯150 mL洗脱，收集洗脱液，减压回收至干，残渣加甲醇溶解，移至10 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按痹痛灵酊的处方制备不含雷公藤的阴性样品，按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.5 专属性试验
精密吸取上述3种溶液各5 mL，注入液相色谱仪，色谱图见图1。表明组方中其他成分对于雷公藤中雷公藤内酯醇的测定无干扰。
2.6 线性范围考察
精密吸取雷公藤内酯醇对照品贮备液（48 ?g/mL）1、2、3、4、5、6 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，记录峰面积，以雷公藤内酯醇进样量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程Y=5×106X-1 887.5（n=6），r=0.999 8，结果表明雷公藤内酯醇在0.019 2～0.115 2 ?g范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.7 精密度试验
精密吸取对照品溶液10 ?L，重复进样6次，在上述色谱条件下测定峰面积，计算得RSD=1.24%，表明仪器精密度良好。
2.8 稳定性试验
精密吸取同一批号的供试品溶液10 ?L，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，在上述色谱条件下测定峰面积，计算得RSD=1.96%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.9 重复性试验
精密量取同一批号痹痛灵酊样品6份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定峰面积，进样量10 ?L，雷公藤内酯醇色谱峰面积RSD=1.75%，测得雷公藤内酯醇的平均含量0.50 ?g/mL，表明本方法的重复性良好。
2.10 加样回收率试验
精密量取同一批号样品共6份，加入相应的雷公藤内酯醇对照品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定峰面积，进样量10 ?L，计算得雷公藤内酯醇回收率为100.76%，RSD=1.85%。结果表明本方法准确可靠。见表1。
2.11 样品含量测定
精密量取不同批号的样品100 mL，按上述供试品溶液制备方法进行，取供试品溶液10 ?L，注入液相色谱仪，测定。结果见表2。
3 讨论
本制剂中雷公藤为君药，雷公藤中的雷公藤内酯醇被认为既是主要活性成分，也是引起不良反应的主要成分[4]。因此，对制剂中的雷公藤内酯醇进行含量测定具有重要的意义。
取雷公藤内酯醇对照品溶液进行全波长扫描，根据扫描图谱选择最大吸收波长处为检测波长，即检测波长218 nm[5]。
试验中对痹痛灵酊提取溶剂进行了研究，分别以甲醇、氯仿、乙酸乙酯作为提取溶剂，结果表明，以乙酸乙酯作为提取溶剂时样品中雷公藤内酯醇含量最高，每次50 mL，提取3次便可提取完全，然后上中性氧化铝柱，以石油醚-乙酸乙酯（1∶4）、乙酸乙酯、氯仿-甲醇（95∶5）考察洗脱溶剂，结果表明，以乙酸乙酯进行洗脱时样品中雷公藤内酯醇含量最高且液相图谱中的分离度好，150 mL乙酸乙酯便可洗脱完全。
由于雷公藤药材中的雷公藤内酯醇含量较低，因此给制剂中的雷公藤内酯醇含量测定带来了诸多困难。在色谱条件的摸索过程中，发现温度对目标峰的分离有较大的影响，经多次试验，最终确定了雷公藤内酯醇HPLC测定时的柱温为20 ℃，分离度良好。
采用HPLC测定痹痛灵酊中雷公藤内酯醇含量，结果证明此方法稳定可行，方法专属性强，精密度高，重复性好，回收率符合规定，可以用于本制剂的质量控制。
参考文献：
[1] 毛晓丹，孙赛君，裴紫燕，等.雷公藤内酯醇对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞IL-18及其受体表达的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2009，25（7）：606-608.
[2] 韦登明，焦效兰，孟丹，等.雷公藤内酯醇抑制佐剂性关节炎组织NO生成的实验研究[J].浙江中医杂志，2007，42（11）：661-663.
[3] 库尔班江，张焱.高效液相色谱法测定雷公藤类药材及其制剂中雷公藤甲素的含量[J].中南药学，2008，6（5）：552-555.
[4] 王月敏，张世良，夏素霞，等.雷公藤的毒性研究及对策[J].四川生理科学杂志，2008，30（1）：28-31.
[5] 郑笑为，刘燕，鲁静.HPLC法测定雷公藤原料中雷公藤甲素的含量[J].中国药事，2008，22（6）：487-488.
（收稿日期：2011-09-15，编辑：陈静）
关键词：痹痛灵酊；高效液相色谱法；雷公藤内酯醇
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）04-0051-02
痹痛灵酊为福建中医药大学附属人民医院院内外用制剂，具有祛风除湿、清热通络、消肿定痛之功效，临床用于风湿痹阻所致的关节疼痛、腰腿疼痛、屈伸不利等。方中雷公藤为君药，有祛风除湿、活血通络、消肿定痛之功，用于治疗风湿热痹痛，关节僵硬，屈伸不利，腰膝疼痛等症。近年研究发现，雷公藤内酯醇能够抑制佛波酯刺激的关节滑膜成纤维细胞白细胞介素-18及其受体表达[1]。另有文献报道，雷公藤内酯醇可抑制佐剂性关节炎大鼠病变关节组织组织型一氧化氮合酶表达从而减少病变关节组织一氧化氮含量[2]。为控制本品工艺质量，对制剂中雷公藤内酯醇成分进行了高效液相色谱法（HPLC）含量测定的研究，现报道如下。
1 仪器与试药
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适用性试验
Dionex Acclaim 120 C18色谱柱（5 ?m，4.6 mm×250 mm）；ODS预柱（美国迪马科技）；流动相：甲醇-水（35∶65）；流速：1.0 mL/min；柱温：20 ℃；检测波长：218 nm；进样量：10 ?L；理论塔板数以雷公藤内酯醇计算不低于4 000[3]。
2.2 对照品溶液的制备
取雷公藤内酯醇对照品适量，精密称定，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，制成每1 mL含雷公藤内酯醇48 ?g的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密量取本品100 mL，水浴上挥干乙醇后，加纯化水至50 mL，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次50 mL，合并提取液，回收乙酸乙酯，浓缩干少量，上中性氧化铝柱（湿法装柱，10 g，100～200目），用乙酸乙酯150 mL洗脱，收集洗脱液，减压回收至干，残渣加甲醇溶解，移至10 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按痹痛灵酊的处方制备不含雷公藤的阴性样品，按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.5 专属性试验
精密吸取上述3种溶液各5 mL，注入液相色谱仪，色谱图见图1。表明组方中其他成分对于雷公藤中雷公藤内酯醇的测定无干扰。
2.6 线性范围考察
精密吸取雷公藤内酯醇对照品贮备液（48 ?g/mL）1、2、3、4、5、6 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，记录峰面积，以雷公藤内酯醇进样量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程Y=5×106X-1 887.5（n=6），r=0.999 8，结果表明雷公藤内酯醇在0.019 2～0.115 2 ?g范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.7 精密度试验
精密吸取对照品溶液10 ?L，重复进样6次，在上述色谱条件下测定峰面积，计算得RSD=1.24%，表明仪器精密度良好。
2.8 稳定性试验
精密吸取同一批号的供试品溶液10 ?L，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，在上述色谱条件下测定峰面积，计算得RSD=1.96%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.9 重复性试验
精密量取同一批号痹痛灵酊样品6份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定峰面积，进样量10 ?L，雷公藤内酯醇色谱峰面积RSD=1.75%，测得雷公藤内酯醇的平均含量0.50 ?g/mL，表明本方法的重复性良好。
2.10 加样回收率试验
精密量取同一批号样品共6份，加入相应的雷公藤内酯醇对照品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定峰面积，进样量10 ?L，计算得雷公藤内酯醇回收率为100.76%，RSD=1.85%。结果表明本方法准确可靠。见表1。
2.11 样品含量测定
精密量取不同批号的样品100 mL，按上述供试品溶液制备方法进行，取供试品溶液10 ?L，注入液相色谱仪，测定。结果见表2。
3 讨论
本制剂中雷公藤为君药，雷公藤中的雷公藤内酯醇被认为既是主要活性成分，也是引起不良反应的主要成分[4]。因此，对制剂中的雷公藤内酯醇进行含量测定具有重要的意义。
取雷公藤内酯醇对照品溶液进行全波长扫描，根据扫描图谱选择最大吸收波长处为检测波长，即检测波长218 nm[5]。
试验中对痹痛灵酊提取溶剂进行了研究，分别以甲醇、氯仿、乙酸乙酯作为提取溶剂，结果表明，以乙酸乙酯作为提取溶剂时样品中雷公藤内酯醇含量最高，每次50 mL，提取3次便可提取完全，然后上中性氧化铝柱，以石油醚-乙酸乙酯（1∶4）、乙酸乙酯、氯仿-甲醇（95∶5）考察洗脱溶剂，结果表明，以乙酸乙酯进行洗脱时样品中雷公藤内酯醇含量最高且液相图谱中的分离度好，150 mL乙酸乙酯便可洗脱完全。
由于雷公藤药材中的雷公藤内酯醇含量较低，因此给制剂中的雷公藤内酯醇含量测定带来了诸多困难。在色谱条件的摸索过程中，发现温度对目标峰的分离有较大的影响，经多次试验，最终确定了雷公藤内酯醇HPLC测定时的柱温为20 ℃，分离度良好。
采用HPLC测定痹痛灵酊中雷公藤内酯醇含量，结果证明此方法稳定可行，方法专属性强，精密度高，重复性好，回收率符合规定，可以用于本制剂的质量控制。
参考文献：
[1] 毛晓丹，孙赛君，裴紫燕，等.雷公藤内酯醇对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞IL-18及其受体表达的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2009，25（7）：606-608.
[2] 韦登明，焦效兰，孟丹，等.雷公藤内酯醇抑制佐剂性关节炎组织NO生成的实验研究[J].浙江中医杂志，2007，42（11）：661-663.
[3] 库尔班江，张焱.高效液相色谱法测定雷公藤类药材及其制剂中雷公藤甲素的含量[J].中南药学，2008，6（5）：552-555.
[4] 王月敏，张世良，夏素霞，等.雷公藤的毒性研究及对策[J].四川生理科学杂志，2008，30（1）：28-31.
[5] 郑笑为，刘燕，鲁静.HPLC法测定雷公藤原料中雷公藤甲素的含量[J].中国药事，2008，22（6）：487-488.
（收稿日期：2011-09-15，编辑：陈静）