论文部分内容阅读
目的:大豆异黄酮具有植物雌激素样作用,已受到广泛关注.大豆苷元(daidzein)h大豆异黄酮的一种,具考明显改善心血管功能,降低去卵巢大鼠胆固醇水平和调节血脂的功效,缓解由于更年期雌激素不足所引起的骨质疏松等症状等多种药理活性.本文建立测定大鼠血浆重大豆苷元浓度的UPLC法,探讨大豆苷元在大鼠体内的药代动力学过程.仪器:Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪,Empower 2色谱工作站(美国Waters公司).色谱柱:Acquity UPLCTM BEH C18 (100 mm×2.1 mm,1.7μm);流动相:乙腈-0.1%甲酸水溶液(26∶74);检测波长:260nm;进样量:2μL;柱温:40℃;流速:0.4mL·min-1.方法:Sprague-Dawley雌性大鼠6只,体重(250±±20)g,ig绘予30mg·kg-1大豆苷元混悬液,于给药前及绘药后5、10、20、 40、60、120、240、360、480、720、1440min眼眶静脉丛采血约0.4ml,4000rpm·minq离心10min,分取血浆,置-20℃保存各用.血浆室湿解冻后,精密吸取0.1mL子5mL离心管中,加入β-葡萄糖醛酸苷酶溶液(1000 U·mL-1) 25μL,置37℃水浴中孵育16h,精密加入染料本索内标液(1mg·L-1)20μL,混匀,加乙酸乙酯1.0mL及0.1mol·L-1盐酸溶液20μ,后,涡旋振荡3min,4000 r·min-1离心10min,取乙酸乙酯层0.8mL,、40℃水浴氮气流吹于,加入甲醇100μL复溶解,涡旋30s,12000 r·min-1离心5min,取上清液进样.血浆样品经β-葡萄糖醛酸苷酶水解后,采用UPLC法测定大豆苷元浓度,并用DAS软件拟合并计算其药代动力学参数.结果:方法专属性分别取空白血浆、空白血浆加大豆苷元及染料术素(内标)、大鼠血浆样品各2μL注入超离效液相色谱仪,得UPLC色谱图,见图1.从色谱图上可知,大豆苷元和染料木素(内标)的保留时间分别为2.4min和4.9 min,大豆苷元和染料木素的色谱峰分离良好,空白血浆中内源性杂质无干扰.方法回收率取空白血浆加入大豆苷元对照品溶液适量,配成40,100,400 μg·L-1的低、中、高浓度质控样品各5论,按血浆样品处理操作,随标准曲线同时测定,以实测量与加入量的之比计算方法回收率,低、重、高测定的平均方法回收率为(96.9±3.0)%,(96.9±2.8)%,(96.0±4.1)%.提取回收率取40,100,400 μg·L-1低、中、高三个浓度质控样品各5份,按血浆样品处理操作,以提取后低、重、高浓度大豆苷元色谱峰面积(As)与未经提取相同浓度直接进样的对照品色谱峰面积(Ae),按下式计算提取回收率(%)=5A/4Aj 100%.低、重、高三种浓度平均提取回收率分别为(87.4±4.9)%,(87.4±4.6)%,(88.9±7.1)%.精密度试验取40,100,400 μg·L-1低、中、高三个浓度的质控样品各5份,按血浆样品处理操作,测定日内精密度,低、重、高三种浓度的日内相对标准偏差分别为3.03%,2.82%,4.07%.并子试验的第1天至第5天分别测定日间精密度,低、中、高三种浓度的日间相对标准偏差分别为4.79%,2.81%,3.12%.日内、日间RSD%均小于10%,符合生物样本测定指导原则的要求.稳定性考察大豆苷元血浆样品(40,100,400 μg·L-1)室温放置12h,测定结果分别为96.5%±4.1,102.0%±2.0,101.0%±3.4 (n=3),反复冻融2次的测定结果分别为94.5%±1.3,102.7%±3.0,101.1%±0.3(n=6).结果表明血浆扬品在室温放置12h、冻融2次均稳定性良好.血浆中大豆苷元药代动力学参数大鼠遮给予30 mg·kg-1的大豆苷元混悬液,测得的血药浓度(c)-时间(t)曲线,见图2,血L药浓度-时间数据用DAS1.0药代动力学程序处理.大鼠灌胃给药后,血浆中大豆苷元的药时曲线呈二室开放模型,大豆苷元在大鼠体内的主要药动学参数Tmax,Cmax t1/2β,AUC(0-t),AUC(0-∞),CL,V4分别为33.3 min, 355.4μ g· L-1,915.7 min,213.2 mg·min·L-1, 218.2 mg·min·L-1,0.1467 L·min-1·kg-1,74.4 L·kg-1.结论:该方法操作简便、快速、专属性强,可用、大豆苷无体内大批量样品定量分析及药代动力学研究.