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背景:吴茱萸汤是《伤寒论》中的名方,《方剂学》将其收入温里剂。该方由吴茱萸、人参、生姜、大枣组成,具有温中补虚,降逆止呕的功用,主治阳明寒呕、少阴吐利和厥阴头痛,现多用于治疗消化性疾病如食道反流、消化性溃疡、浅表性胃炎等病属于虚寒之证者。现代研究证明寒热感受是通过热敏通道介导的,热敏通道在寒热相关的疼痛中也发挥核心作用。既有研究表明,吴茱萸汤包含吴茱萸碱、吴茱萸次碱和姜酚等至少7种TRPV1/TRPA1激动剂。热通道的激动剂通过活化TRPV1可以交叉脱敏寒通道TRPA1引起的冷痛。吴茱萸汤可能通过该机制发挥温中散寒止痛的作用。内脏疼痛作为一种常见的内脏感觉,是许多疾病共有的症状。内脏的冷痛主要是内脏感觉神经末梢上寒通道活化的结果,因此寒通道的激动剂可以模拟内脏的冷痛,而热通道的活化和脱敏可以消除这种疼痛。本研究在体外(细胞)和体内(小鼠)模型上,采用全细胞膜片钳记录技术、免疫组织化学、免疫蛋白印迹(western blot)技术以及动物行为学方法,探讨热敏通道在吴茱萸汤温中散寒止痛中所发挥的作用。研究目的:吴茱萸汤散寒止痛的机制研究。研究方法:1.在转染TRPV1的HEK293细胞上,运用全细胞膜片钳技术测量吴茱萸汤中的部分标志性成分吴茱萸碱、吴茱萸次碱、10-姜酚分别或配伍对热敏通道TRPV1跨膜电流的影响。2.在TRPA1激动剂芥子油介导的小鼠内脏疼痛模型上,观察吴茱萸汤及其拆方对小鼠疼痛行为的影响。3.在TRPA1激动剂芥子油介导的小鼠内脏疼痛模型上,应用免疫组化及免疫蛋白印迹(western blot)技术,检测TRPA1与TRPV1在模型小鼠结肠组织中的表达。结果:1.全细胞膜片钳实验与细胞外液对比,吴茱萸碱、吴茱萸次碱和10-姜酚均能诱导TRPV1/HEK293细胞产生明显跨膜电流,吴茱萸碱诱导的跨膜电流是辣椒素诱导的跨膜电流的1/3。吴茱萸碱在1μ M,10 μM,30 μM,50 μM这四个浓度下产生的跨膜电流无显著差异(P>0.05)。10M10-姜酚和50μM浓度下产生的跨膜电流无显著差异,但与1μM浓度下诱导的跨膜电流差异显著(P<0.01)。1μM吴茱萸次碱产生的跨膜电流约为10μM产生的跨膜电流的一半。11μM的吴茱萸碱和相同浓度的10-姜酚产生的跨膜电流相当(P>0.05),但是明显高于相同浓度下吴茱萸次碱诱导的电流。10 μM10-姜酚+10 μ M吴茱萸碱配伍产生的跨膜电流明显高于10 μ M吴茱萸碱单独使用产生的跨膜电流(P<0.001),同时也明显高于10 μM10-姜酚单独使用产生的跨膜电流(P<0.05)。另一个组合10 μM10-姜酚+10 μ M吴茱萸次碱诱导产生的电流也高于10 uM吴茱萸次碱或10 μ M10-姜酚单独使用产生的跨膜电流(P<0.05)。吴茱萸碱+10-姜酚和吴茱萸次碱+10-姜酚这两个不同组合诱导产生的跨膜电流都能被辣椒平(TRPV1通道特异性拮抗剂)完全阻断。吴茱萸碱预处理后可明显抑制10-姜酚诱导产生的电流(P<0.001)和10-姜酚+吴茱萸碱诱导产生的电流(P<0.01)。吴茱萸碱预处理后,30μM辣椒素诱导产生的跨膜电流与单独使用对比显著减少(P<0.001)。2.动物行为学实验不同剂量的吴茱萸汤对小鼠疼痛行为的影响。模型组小鼠的疼痛行为频次明显高于正常组。预处理4天后,与模型组对比,吴茱萸汤各剂量给药组疼痛行为频次明显降低。其中,高剂量组与中剂量组疼痛行为频次对比无显著差异(P>0.05),但都低于低剂量组疼痛行为频次,差异显著(P<0.05)。造模后,小鼠疼痛行为出现时间显著缩短(30s以内),与正常组(100s左右)对比差异极显著(P<0.001)。吴茱萸汤高、中、低三个剂量组均能推迟小鼠疼痛行为出现时间,与模型组对比差异极显著(P<0.001)。吴茱萸汤全方及拆方对小鼠疼痛行为的影响。预处理4天后,布洛芬阳性对照组、吴茱萸汤组、吴茱萸+生姜组、吴茱萸组、生姜组小鼠疼痛行为频次明显降低,与模型组对比差异显著。吴茱萸组、生姜组疼痛行为出现时间与模型组对比无显著差异(P>0.05)。吴茱萸汤全方疼痛行为出现时间迟于吴茱萸+生姜组,差异显著(P<0.01)。大枣+人参组无论在疼痛行为频次还是疼痛行为出现时间与模型组对比均无显著差异(P>0.05)。吴茱萸汤在不同时间预处理对小鼠疼痛行为的影响。各实验组给药后,吴茱萸汤预处理2h、4h及吴茱萸+生姜水煎液预处理2h、4h均可显著降低小鼠的疼痛行为,与模型组对比差异极显著(P<0.001)。吴茱萸+生姜水煎液预处理1 h可降低疼痛行为频次,与模型组对比差异显著(P<0.05)。然而,吴茱萸汤预处理1h对小鼠的疼痛行为频次无明显影响,与模型组对比无显著差异(P>0.05)。吴茱萸汤预处理1h,2h和吴茱萸+生姜水煎液预处理1h,2h可以明显推迟小鼠疼痛行为出现时间,与模型组对比差异显著。吴茱萸汤及吴茱萸+生姜组预处理4h疼痛行为出现时间与模型组对比无显著差异(P>0.05)。吴茱萸汤与几种拮抗剂使用对小鼠疼痛行为的影响。钌红、辣椒平、昂丹司琼等药物单独预处理内脏疼痛行为频次与模型组对比无显著差异(P>0.05)。同时,钌红、辣椒平、昂丹司琼分别与吴茱萸汤联合使用后疼痛行为频次与模型组也无显著差异(P>0.05)。然而,纳洛酮单独使用和与吴茱萸汤联合使用小鼠内脏疼痛行为频次降低,与模型组差异显著。3.免疫组化及免疫蛋白印迹(western blot)实验吴茱萸汤对小鼠肠道TRPV1/TRPA1表达的影响。吴茱萸汤1次性给药1h后结肠组织中TRPV1表达明显高于正常组(P<0.001)。给药2h后,TRPV1表达明显低于给药1h组(P<0.01)。模型组小鼠结肠组织中TRPA1表达明显高于正常组,差异显著。吴茱萸汤和布洛芬预处理2h后能使小鼠结肠组织中TRPA1表达下调,与模型组对比差异显著(P<0.01)。辣椒平预处理对小鼠结肠组织中TRPA1表达无明显影响,与模型组对比无显著差异(P>0.05)。辣椒平联合吴茱萸汤预处理可上调吴茱萸汤结肠组织中TRPA1阳性表达,与单独用吴茱萸汤对比差异显著,与模型组对比无显著差异(P>0.05)。结论及意义:1.吴茱萸汤中的吴茱萸碱、吴茱萸次碱、10-姜酚是热敏通道TRPV1的激动剂。它们之间的配伍可以增强对TRPV1的作用。2.热敏通道TRPV1、TRPA1是吴茱萸汤发挥散寒止痛作用的关键环节。