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摘 要 应用SSR和SRAP标记，对20份柱花草种质的遗传多样性进行研究。从113对SSR引物中筛选出41对多态性较好的引物，共扩增出229个位点，多态性比率达76.86%，平均每个引物扩增多态性位点4.29个。从224对SRAP引物中筛选出25对多态性较好的引物，共扩增出359个位点，平均每个引物扩增多态性10.72个，多态性比率达74.65%。综合SSR和SRAP两种标记对20份材料计算出的遗传相似系数（GS）为0.65～0.90，表明柱花草种质遗传多样性比较丰富；通过UPGMA聚类分析，把这20份材料聚为3个类群，其中类群Ⅰ又分为4个亚类。
关键词 柱花草；遗传多样性；SSR；SRAP
中图分类号 S541.9 文献标识码 A
Abstract SSR and SRAP molecular markers were used to study genetic diversity among 20 Stylosanthes cultivars. 41 of 113 SSR and 25 of 224 SRAP pairs of primer were employed. 229 SSR and 359 SRAP markers were obtained respectively， with polymorphism 76.86% and 74.65%， respectively. The genetic similarity coefficients were 0.65～0.90. It indicated that Stylosanthes had an abundant genetic polymorphism in different cultivars. In addition， using UPGMA-clustering analysis， the materials could be divided into three groups， and groups I could be further divided into four sub-groups.
Key words Stylosanthes； Genetic diversity； SSR； SRAP
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.019
柱花草（Stylosanthes spp.）是热带、亚热带地区重要的豆科牧草和饲料植物资源，原产南美洲及加勒比海地区，中国于20世纪60年代开始引入[1]，经引种选育和诱变育种育出了热研2号、热研5号、热研7号、热研10号、热研20号、热研21号等9个柱花草品种并应用于生产，柱花草已成为我国热区重要的替代蛋白质饲料资源和水土保持当家草种[2-3]。
培育优质、高产、抗逆性强的柱花草新品种，是目前我国柱花草育种的主要目标。分子标记方法能真实反映品种间的亲缘关系，从而为杂交育种中亲本的选配提供理论支持[4]。简单序列重复标记（Simple Sequence Repeat， SSR）具有多态性高、检测简便、共显性遗传等特点[5]，是一种应用十分广泛的分子标记方法；而相关序列扩增多态性（Sequence Related Amplified Polymorphism， SRAP）由美国加州大学Li与Quiros于2001年开发出来，作为近年来新开发的一种分子标记技术，具有操作简便、多态性高、高效、在基因组上分布均匀等优点[6]。2种标记联用进行遗传多样性分析的研究在国内外都有报道[7-9]。本研究应用SSR和SRAP分子标记技术，对中国热带农业科学院（CATAS）的部分选育柱花草品种、航空诱变柱花草新品系及国外引进的柱花草种质[10]进行了遗传多样性分析，从而为柱花草种质鉴定及育种实践提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试种质 实验选用的20份柱花草品种（品系）由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供（表1）。这些柱花草种质为该所育成的航空诱变品种（7号和13号）、航空诱变品系（1号～6号、8号～12号）以及从国外引进优良种质（14号～20号）。
1.1.2 试剂和仪器 试验所用EasyTaqR DNA Polymerase for PAGE，10×EasyTaqR Buffer for PAGE，2.5 mmol/L dNTPs，6×DNA Loading Buffer购自北京全式金生物技术有限公司。DSTM 2 000 Marker购自广州东盛生物科技有限公司。PCR仪为Biometra TGradient，电泳系统为北京六一厂生产的DYY-6C和DYC-23。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取方法 取柱花草嫩叶，采用改良CTAB法[11]提取基因组总DNA。
1.2.2 PCR反应体系和扩增程序 SSR-PCR扩增总反应体系为20 μL，其中Taq Polymerase 0.3 μL﹑10×Taq Buffer 2 μL﹑2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL﹑10 μmol/L引物0.8 μL﹑50 ng/μL模板DNA 2.5 μL﹑用ddH2O补足体系；SSR-PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。SRAP-PCR扩增总反应体系为25 μL，其中Taq Polymerase 0.2 μL﹑10×Taq Buffer 2.5 μL﹑2.5 mmol/L dNTPs 2 μL﹑10 μmol/L引物0.75 μL﹑50 ng/μL模版DNA 0.5 μL﹑用ddH2O补足体系；SRAP-PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，5个循环；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。4 ℃保存。 1.2.3 引物的筛选 本实验所用SSR引物通过NCBI公共数据库查得，SRAP引物参照Li等[9]所选的引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。利用3个种质进行引物筛选，选出多态性好的引物再对20份材料进行PCR扩增。
1.2.4 结果检测 PCR扩增产物用8% PAGE胶进行检测，正式电泳前对已制好的PAGE胶预电泳30 min，之后加入3 μL反应产物点样，250 V恒压电泳3 h。电泳结束后银染检测。
1.3 数据分析
统计SSR和SRAP多态性条带（有带读1，没有带读0），用NTSYS-2.10e软件计算材料间遗传相似系数（GS），按非加权平均法（UPGMA）聚类分析构建树状图。
2 结果与分析
2.1 SSR和SRAP标记的多态性
从113对SSR引物中筛选出41对多态性较好引物组合对20个柱花草品种（品系）进行分析，共得到229个位点，多态性位点176个，多态性比率为76.86%，平均每个引物扩增多态性位点4.29个（表2）。从224对SRAP引物中筛选出25对多态性较好的组合进行分析，一共得到359个位点，多态性位点268个，多态性比率为74.65%，平均每个引物扩增多态性位点10.72个（表3）。SSR引物SG03G8（见图1）和SRAP引物me9+em9的扩增结果见图2。统计扩增片段大小在100～500 bp之间。
2.2 综合2种标记的聚类分析
用NTSYS-2.10e软件对20份材料基于SSR和SRAP标记上的遗传相似系数（GS）进行计算，其GS值变换范围在0.65～0.90之间，平均GS值为0.779 731。TPRC2001-15与TPRC2001-81遗传相似系数最大为0.895 548，热研21号和马弓形柱花草遗传相似系数最小为0.601 027。
用UPGMA法对SSR和SRAP所得的数据进行聚类分析（图3）。在GS=0.79时，将材料分为3个群体。第Ⅰ群体包含17份种质，都为圭亚那柱花草。第Ⅱ群体只有Tardio柱花草1个品种，Tardio柱花草虽然是圭亚那种，但其表型与其他圭亚那柱花草有很大差异，尤其是其叶片表面有粘稠物质分泌，属高抗病柱花草品系。第Ⅲ群体包含马弓形柱花草和Oxley柱花草，田间表现都有茎的生长习性为斜倚型，植株矮小，叶片短小，产量较低的特点，两者之间的遗传系数为0.845 89，说明亲缘关系较近。
在GS=0.83时，又可以将第Ⅰ群体分为A、B、C和D 4个亚类，A亚类包含TPRC2001-1、TPRC2001-5、TPRC2001-7、TPRC2001-9、TPRC2001-15、TPRC2001-79、TPRC2001-81；B亚类包含TPRC2001-55、TPRC2001-80、TPRC2001-84、TPRC2001-85、热研20号柱花草，这12个品种（品系）为热研2号柱花草太空诱变品系，其遗传相似系数相近，说明太空诱变品系遗传变异不大；C亚类包含Nina柱花草、Temprano柱花草、Stylo540（3008）、Stylo541（3009），这4个株系为澳大利亚引进品种，聚为一类说明其亲缘关系较近；D亚类为热研21号柱花草，是20份柱花草材料中唯一开白花的品种。
3 讨论与结论
本试验分别采用SSR和SRAP 2种分子标记技术对20份柱花草种质进行遗传分析，结果显示这2种标记均具有较高的多态性比率（分别为76.86%和74.65%）。但SSR多态性比率较蒋昌顺等[12]报道的低，SRAP多态性比率也较张伟丽等[13]报道的低，这可能是由于他们所用的实验材料种间差异较大遗传背景较宽，而本实验只有1份材料不是圭亚那种，且多是“热研2号”柱花草航空诱变选出的品种或品系，遗传背景较窄造成的，SSR引物选择不同也是原因之一。
SSR标记是分布于真核生物基因组中的简单重复序列，主要集中在非编码区，更多地反映了全基因组的遗传丰富度[14]；而SRAP标记目标扩增区域是开放读码框，功能区域比基因组的其他区域更具保守性[15]。在进行谱系分析时，为了得到尽可能准确的亲缘关系进化图，用不同的分子标记综合起来进行亲缘关系的评价是非常必要的，综合多种分子标记的分析可以有效减少各自方法产生的误差[16]。本实验综合SSR和SRAP两种标记所得的数据分析柱花草品种间的亲缘关系，TPRC2001-15与TPRC2001-81遗传相似系数最大为0.895 548，这两个诱变品系的产量较高和开花期接近[17]。热研21号（S. guianensis cv.Ryan no.21）和马弓形柱花草（S.hippocampoides Fine stem stylo）遗传相似系数最小（0.601 027），两者属于不同种，热研21号柱花草茎的生长习性为直立型、开白花、产量高，而马弓形柱花草为斜倚型植株、黄花、植株矮小。
通过聚类分析作图将20份柱花草材料分为3类群。第Ⅰ群体A、B和D亚类中的13个株系为热研2号柱花草太空诱变后代，其在产量、花期和抗病等方面差异明显[17]。热研21号柱花草单独在D亚类，也是这20份种质中唯一开白花的柱花草，没有和其他热研2号柱花草诱变品系聚在一起可能是产生了较大变异，此聚类结果可以在分子水平上提供依据。
Tardio柱花草（S. guianensis Tardio）单独聚为第Ⅱ类，Tardio柱花草具有叶片表面粘稠的显著特点，且是20份种质中唯一来源于哥伦比亚，因此它跟其他圭亚那类柱花草的遗传相似系数较低。
马弓形柱花草（S. hippocampoides Fine stem stylo）和Oxley柱花草（S. guianensis cv. Oxley），虽然从种名来看应该分属于不同种，但也存在着不同的观点，如Orr D M等[18]认为马弓形柱花草来源于Oxley柱花草，是Oxley柱花草的早花品种。本实验分子标记聚类结果显示两者聚成第Ⅲ类（见图3），且两者田间表型相似，都具有茎的生长习性为斜倚型，叶片短小、植株矮小、早花等特点。但是否来源于同一个种，有待进一步研究。 综上所述，应用SSR及SRAP标记聚类分析的结果表明了供试的柱花草材料的遗传关系与其地理分布、生态类型、形态特征等具有一定的相关性。能够有效分析柱花草种质的亲缘关系和遗传多样性。综合2种标记协同的方法，对柱花草基因的功能区域和全基因组有较好的检测能力，对柱花草种质资源的鉴定、利用及其育种实践等具有一定的参考价值。
参考文献
[1] Guodao L， Phaikaew C， Stur W W. Status of Stylosanthes development in other countries. II. Stylosanthes development and utilisation in China and south-east Asia[J]. Tropical Grasslands， 1997， 31（5）： 460-466.
[2] 唐燕琼， 吴紫云， 刘国道， 等. 柱花草种质资源研究进展[J]. 植物学报， 2009， 44（6）： 752-762.
[3] 白昌军， 刘国道， 陈志权， 等. 热研20号太空柱花草选育研究报告[J]. 热带作物学报， 2011， 34（1）： 33-41.
[4] 王玉平， 郭明星， 王 峰， 等. SSR标记遗传距离与杂交稻农艺性状一般配合力的相关性分析[J]. 分子植物育种， 2013， 11（3）： 317-325.
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[18] Orr D M. Grazing management influences the dynamics of populations of Stylosanthes hippocampoides（Oxley fine stem stylo）[J]. TG： Tropical Grasslands， 2008， 42（4）： 193.
关键词 柱花草；遗传多样性；SSR；SRAP
中图分类号 S541.9 文献标识码 A
Abstract SSR and SRAP molecular markers were used to study genetic diversity among 20 Stylosanthes cultivars. 41 of 113 SSR and 25 of 224 SRAP pairs of primer were employed. 229 SSR and 359 SRAP markers were obtained respectively， with polymorphism 76.86% and 74.65%， respectively. The genetic similarity coefficients were 0.65～0.90. It indicated that Stylosanthes had an abundant genetic polymorphism in different cultivars. In addition， using UPGMA-clustering analysis， the materials could be divided into three groups， and groups I could be further divided into four sub-groups.
Key words Stylosanthes； Genetic diversity； SSR； SRAP
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.019
柱花草（Stylosanthes spp.）是热带、亚热带地区重要的豆科牧草和饲料植物资源，原产南美洲及加勒比海地区，中国于20世纪60年代开始引入[1]，经引种选育和诱变育种育出了热研2号、热研5号、热研7号、热研10号、热研20号、热研21号等9个柱花草品种并应用于生产，柱花草已成为我国热区重要的替代蛋白质饲料资源和水土保持当家草种[2-3]。
培育优质、高产、抗逆性强的柱花草新品种，是目前我国柱花草育种的主要目标。分子标记方法能真实反映品种间的亲缘关系，从而为杂交育种中亲本的选配提供理论支持[4]。简单序列重复标记（Simple Sequence Repeat， SSR）具有多态性高、检测简便、共显性遗传等特点[5]，是一种应用十分广泛的分子标记方法；而相关序列扩增多态性（Sequence Related Amplified Polymorphism， SRAP）由美国加州大学Li与Quiros于2001年开发出来，作为近年来新开发的一种分子标记技术，具有操作简便、多态性高、高效、在基因组上分布均匀等优点[6]。2种标记联用进行遗传多样性分析的研究在国内外都有报道[7-9]。本研究应用SSR和SRAP分子标记技术，对中国热带农业科学院（CATAS）的部分选育柱花草品种、航空诱变柱花草新品系及国外引进的柱花草种质[10]进行了遗传多样性分析，从而为柱花草种质鉴定及育种实践提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试种质 实验选用的20份柱花草品种（品系）由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供（表1）。这些柱花草种质为该所育成的航空诱变品种（7号和13号）、航空诱变品系（1号～6号、8号～12号）以及从国外引进优良种质（14号～20号）。
1.1.2 试剂和仪器 试验所用EasyTaqR DNA Polymerase for PAGE，10×EasyTaqR Buffer for PAGE，2.5 mmol/L dNTPs，6×DNA Loading Buffer购自北京全式金生物技术有限公司。DSTM 2 000 Marker购自广州东盛生物科技有限公司。PCR仪为Biometra TGradient，电泳系统为北京六一厂生产的DYY-6C和DYC-23。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取方法 取柱花草嫩叶，采用改良CTAB法[11]提取基因组总DNA。
1.2.2 PCR反应体系和扩增程序 SSR-PCR扩增总反应体系为20 μL，其中Taq Polymerase 0.3 μL﹑10×Taq Buffer 2 μL﹑2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL﹑10 μmol/L引物0.8 μL﹑50 ng/μL模板DNA 2.5 μL﹑用ddH2O补足体系；SSR-PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。SRAP-PCR扩增总反应体系为25 μL，其中Taq Polymerase 0.2 μL﹑10×Taq Buffer 2.5 μL﹑2.5 mmol/L dNTPs 2 μL﹑10 μmol/L引物0.75 μL﹑50 ng/μL模版DNA 0.5 μL﹑用ddH2O补足体系；SRAP-PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，5个循环；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。4 ℃保存。 1.2.3 引物的筛选 本实验所用SSR引物通过NCBI公共数据库查得，SRAP引物参照Li等[9]所选的引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。利用3个种质进行引物筛选，选出多态性好的引物再对20份材料进行PCR扩增。
1.2.4 结果检测 PCR扩增产物用8% PAGE胶进行检测，正式电泳前对已制好的PAGE胶预电泳30 min，之后加入3 μL反应产物点样，250 V恒压电泳3 h。电泳结束后银染检测。
1.3 数据分析
统计SSR和SRAP多态性条带（有带读1，没有带读0），用NTSYS-2.10e软件计算材料间遗传相似系数（GS），按非加权平均法（UPGMA）聚类分析构建树状图。
2 结果与分析
2.1 SSR和SRAP标记的多态性
从113对SSR引物中筛选出41对多态性较好引物组合对20个柱花草品种（品系）进行分析，共得到229个位点，多态性位点176个，多态性比率为76.86%，平均每个引物扩增多态性位点4.29个（表2）。从224对SRAP引物中筛选出25对多态性较好的组合进行分析，一共得到359个位点，多态性位点268个，多态性比率为74.65%，平均每个引物扩增多态性位点10.72个（表3）。SSR引物SG03G8（见图1）和SRAP引物me9+em9的扩增结果见图2。统计扩增片段大小在100～500 bp之间。
2.2 综合2种标记的聚类分析
用NTSYS-2.10e软件对20份材料基于SSR和SRAP标记上的遗传相似系数（GS）进行计算，其GS值变换范围在0.65～0.90之间，平均GS值为0.779 731。TPRC2001-15与TPRC2001-81遗传相似系数最大为0.895 548，热研21号和马弓形柱花草遗传相似系数最小为0.601 027。
用UPGMA法对SSR和SRAP所得的数据进行聚类分析（图3）。在GS=0.79时，将材料分为3个群体。第Ⅰ群体包含17份种质，都为圭亚那柱花草。第Ⅱ群体只有Tardio柱花草1个品种，Tardio柱花草虽然是圭亚那种，但其表型与其他圭亚那柱花草有很大差异，尤其是其叶片表面有粘稠物质分泌，属高抗病柱花草品系。第Ⅲ群体包含马弓形柱花草和Oxley柱花草，田间表现都有茎的生长习性为斜倚型，植株矮小，叶片短小，产量较低的特点，两者之间的遗传系数为0.845 89，说明亲缘关系较近。
在GS=0.83时，又可以将第Ⅰ群体分为A、B、C和D 4个亚类，A亚类包含TPRC2001-1、TPRC2001-5、TPRC2001-7、TPRC2001-9、TPRC2001-15、TPRC2001-79、TPRC2001-81；B亚类包含TPRC2001-55、TPRC2001-80、TPRC2001-84、TPRC2001-85、热研20号柱花草，这12个品种（品系）为热研2号柱花草太空诱变品系，其遗传相似系数相近，说明太空诱变品系遗传变异不大；C亚类包含Nina柱花草、Temprano柱花草、Stylo540（3008）、Stylo541（3009），这4个株系为澳大利亚引进品种，聚为一类说明其亲缘关系较近；D亚类为热研21号柱花草，是20份柱花草材料中唯一开白花的品种。
3 讨论与结论
本试验分别采用SSR和SRAP 2种分子标记技术对20份柱花草种质进行遗传分析，结果显示这2种标记均具有较高的多态性比率（分别为76.86%和74.65%）。但SSR多态性比率较蒋昌顺等[12]报道的低，SRAP多态性比率也较张伟丽等[13]报道的低，这可能是由于他们所用的实验材料种间差异较大遗传背景较宽，而本实验只有1份材料不是圭亚那种，且多是“热研2号”柱花草航空诱变选出的品种或品系，遗传背景较窄造成的，SSR引物选择不同也是原因之一。
SSR标记是分布于真核生物基因组中的简单重复序列，主要集中在非编码区，更多地反映了全基因组的遗传丰富度[14]；而SRAP标记目标扩增区域是开放读码框，功能区域比基因组的其他区域更具保守性[15]。在进行谱系分析时，为了得到尽可能准确的亲缘关系进化图，用不同的分子标记综合起来进行亲缘关系的评价是非常必要的，综合多种分子标记的分析可以有效减少各自方法产生的误差[16]。本实验综合SSR和SRAP两种标记所得的数据分析柱花草品种间的亲缘关系，TPRC2001-15与TPRC2001-81遗传相似系数最大为0.895 548，这两个诱变品系的产量较高和开花期接近[17]。热研21号（S. guianensis cv.Ryan no.21）和马弓形柱花草（S.hippocampoides Fine stem stylo）遗传相似系数最小（0.601 027），两者属于不同种，热研21号柱花草茎的生长习性为直立型、开白花、产量高，而马弓形柱花草为斜倚型植株、黄花、植株矮小。
通过聚类分析作图将20份柱花草材料分为3类群。第Ⅰ群体A、B和D亚类中的13个株系为热研2号柱花草太空诱变后代，其在产量、花期和抗病等方面差异明显[17]。热研21号柱花草单独在D亚类，也是这20份种质中唯一开白花的柱花草，没有和其他热研2号柱花草诱变品系聚在一起可能是产生了较大变异，此聚类结果可以在分子水平上提供依据。
Tardio柱花草（S. guianensis Tardio）单独聚为第Ⅱ类，Tardio柱花草具有叶片表面粘稠的显著特点，且是20份种质中唯一来源于哥伦比亚，因此它跟其他圭亚那类柱花草的遗传相似系数较低。
马弓形柱花草（S. hippocampoides Fine stem stylo）和Oxley柱花草（S. guianensis cv. Oxley），虽然从种名来看应该分属于不同种，但也存在着不同的观点，如Orr D M等[18]认为马弓形柱花草来源于Oxley柱花草，是Oxley柱花草的早花品种。本实验分子标记聚类结果显示两者聚成第Ⅲ类（见图3），且两者田间表型相似，都具有茎的生长习性为斜倚型，叶片短小、植株矮小、早花等特点。但是否来源于同一个种，有待进一步研究。 综上所述，应用SSR及SRAP标记聚类分析的结果表明了供试的柱花草材料的遗传关系与其地理分布、生态类型、形态特征等具有一定的相关性。能够有效分析柱花草种质的亲缘关系和遗传多样性。综合2种标记协同的方法，对柱花草基因的功能区域和全基因组有较好的检测能力，对柱花草种质资源的鉴定、利用及其育种实践等具有一定的参考价值。
参考文献
[1] Guodao L， Phaikaew C， Stur W W. Status of Stylosanthes development in other countries. II. Stylosanthes development and utilisation in China and south-east Asia[J]. Tropical Grasslands， 1997， 31（5）： 460-466.
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