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摘要 [目的]研究灵芝（Ganoderma lucidum）固体发酵所得漆酶粗酶液对蒽醌染料进行脱色的条件。[方法]分别研究不同的pH、染料浓度、温度、酶用量、反应时间等条件对活性艳色蓝XBR染料脱色的影响。[结果]脱色的适宜条件为：在 pH 3.5、40 ℃、60 U/ml灵芝漆酶、200 mg/L染料浓度的条件下反应5 h，活性艳色蓝XBR染料脱色率可达49%。[结论]灵芝固体发酵的漆酶粗酶液在一定条件下对蒽醌染料活性艳色蓝XBR具有较好的脱色效果。
关键词 灵芝漆酶；活性艳色蓝XBR；脱色
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）26-08875-03
Study on the Decolorized Condition on Reactive Brilliant Blue XBR by Laccase of Ganoderma lucidum
HAN Yehao， LING Qingzhi et al
（Medical College Anhui University of Science and Technology， Huainan， Anhui 232001； Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo， Zhejiang 315100）
Abstract [Objective] Decolorization of anthraquinone dye with laccase from Ganoderma lucidum was studied. [Method] Effects of different pH， dye concentrations， temperature， enzyme dosage， reaction time on decolorization of Reactive Brilliant Blue XBR were studied. [Result] The optimal conditions of decolorization are： pH 3.5， 40 ℃， 60 U/ml Ganoderma laccase and 200 mg/L dye concentration， respectively. Under the above conditions， the decolorization rate of Reactive Brilliant Blue XBR was 49% after 5 h catalyzation with the laccase from G. lucidum. [Conclusion] Ganoderma laccase under optimal conditions for Reactive Brilliant Blue XBR has a decolorization effect.
Key words Ganoderma lucidum； Reactive Brilliant Blue XBR； Decolorization
漆酶（E.C.1.10.3.2）是一类含铜的氧化还原酶，一般存在于真菌和植物中。它具有较大的应用价值，在造纸、纺织、食品等领域越来越受到人们的重视[1-4]。XBR是一种蒽醌类染料，为绿光蓝色粉末，染品色泽鲜艳，主要用于棉、粘胶、蚕丝等纤维的染色。蒽醌类染料的废水色度高，成分复杂，其芳香结构不易被破坏，可生化性差，脱色较慢，并且废水中含有有机染料，毒性强，pH波动大，组分变化大，是目前废水治理中的难点之一[5]。目前，利用漆酶对蒽醌类染料降解的研究日益受到关注[6-9]。朱林等[10]利用真菌5319产漆酶对蒽醌类和偶氮类染料进行了脱色研究，取得较好的效果。赵美丽[11]利用白腐真菌对印染类染料处理进行了研究，取得一定的效果。
笔者对灵芝漆酶对蒽醌类染料降解的条件进行优化，找出降解率较高的优化条件，提高降解效率，为灵芝漆酶降解蒽醌类染料研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种。灵芝（Ganoderma lucidum）菌种，由广西大学提供，浙江医药高等专科学校生物药物研究所保藏。
1.1.2 染料。
活性艳色蓝XBR（Reactive Brilliant Blue XBR）染料，由武汉三染染料有限公司提供。
1.1.3 化学试剂。
ABTS[2，2′连氮-二（3乙基苯并噻唑6磺酸）]，分析纯，Sigma 公司产品；醋酸、醋酸钠等试剂均为国产分析纯。
1.1.4 主要仪器。
冷冻离心机，Thermo公司；TU1810SPC紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器公司；酶标仪，Thermo 公司；BSA2245CW电子天平，Sartorius 公司；Starter 3C酸度计，奥豪斯（上海）公司；HH2数显恒温水浴锅，国华电器公司；Crystal ISRDH恒温振荡器，精骐仪器公司。
1.2 方法
1.2.1 粗酶液的制备。
采取常规法固体发酵灵芝，取固体发酵菌丝体，用研钵磨碎后按1∶10在蒸馏水中浸泡24 h，用8层纱布过滤，在12 000 r/min常温离心10 min，取上清液即为粗酶液。
1.2.2 漆酶酶活的测定。
灵芝漆酶酶活力定义：每分钟催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量为一个酶活力单位，单位以U/ml表示。根据文献[12]，以ABTS为底物的标准曲線法，先采用粗的灵芝漆酶与不同浓度的ABTS底物反应足够长的时间后，在420 nm处测定不同浓度ABTS自由基溶液对应的吸光值（A），绘制ABTS自由基浓度—吸光值曲线（图1）。 根据酶活力定义和图1，可以得到酶活力计算公式：
漆酶酶活力=1 000×[0.087×△A+0.002]×稀释倍数/△t
式中，酶活力单位为U/（mol·min）；△A为内反应前后吸光度变化差值；△t为反应时间。再用反应体系总体积 4 ml，包括0.5 ml 0.2 mol/L pH 4.5 醋酸-醋酸钠缓冲液、3 ml 0.5 mmol/L ABTS，其中ABTS由0.2 mol/L pH 4.5 醋酸-醋酸钠缓冲液溶解配制，0.5 ml 用缓冲液适当稀释的酶粗提液，测定反应的前 3 min内反应液在 420 nm 处吸光值OD的增加量，以灭活酶液做空白对照。试验重复3 次，取平均值，计算酶活力。
1.2.3 活性艳色蓝XBR吸收光谱的测定。
用 0.2 mol/L pH 3.5 醋酸-醋酸钠缓冲液配制200 mg/L活性艳色蓝XBR。测定时，稀释到线性范围内，以醋酸-醋酸钠缓冲液为空白对照，进行紫外波长扫描（图2），活性艳色蓝XBR的最大吸收峰在 600 nm 处。因此，研究中所有脱色率均以在600 nm处所测的吸光度OD值来计算。
1.2.4 染料脱色率的计算。
参照漆酶酶活检测体系设置4 ml 脱色反应体系。脱色体系中以 0.2 mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液配制活性艳色蓝XBR，最后加入灵芝漆酶粗酶液启动反应，在所需温度和条件下静置反应一段时间后，测定脱色反应后的溶液在 600 nm 处的吸光度。在相同试验条件下，加入等量 100 ℃灭活 10 min 的酶液作为空白对照，测定其吸光度，按以下公式计算不同脱色条件下的脱色率。
脱色率（%）=（A0-A1）/A0×100
式中，A0为醋酸-醋酸钠缓冲液添加染料在600 nm的OD值；A1为脱色反应后的OD值。试验重复3次，取平均值。
2 结果与分析
2.1 pH对灵芝漆酶粗酶液催化活性艳色蓝XBR脱色的影响
在脱色反应体系中，分别用 pH 为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 的0.2 mol/L 醋酸-醋酸钠为缓冲液，保持其他条件不变，对活性艳色蓝XBR进行脱色降解5 h。由图3可知，pH在3.5～4.5之间脱色效果较好，脱色率在35%以上；当 pH为 3.5 时，脱色率最高为41.53%。因此，确定其脱色最适pH为3.5。
2.2 染料浓度对灵芝漆酶粗酶液催化活性艳色蓝XBR脱色的影响
采用上述最适 pH 3.5、温度和漆酶用量，保持其他条件不变，分别对浓度为50、100、150、200、250、300、350 mg/L活性艳色蓝XBR进行脱色处理 2 h。由图4可知，随着染料浓度的增加，脱色率呈先升后降的趋势。当活性艳色蓝XBR的浓度为200 mg/时，脱色率最高，为48.78%。
入ABTS漆酶脱色率反而下降的现象一致。所以，加入
ABTS不利于灵芝漆酶对活性艳色蓝XBR脱色反应。另外，在最优条件下用恒温振荡器振荡反应，发现与静止反应区别不明显。
3 结论
研究表明，灵芝漆酶粗酶液对活性艳色蓝XBR具有一定的脱色效果，脱色的适宜條件为：pH 3.5、40 ℃、60 U/ml灵芝漆酶、200 mg/L染料浓度，此时蒽醌染料活性艳色蓝XBR脱色率可达49%左右。
虽然目前对漆酶降解染料污水的研究取得一定的进展，但由于染料污水情况复杂，漆酶在染料废水降解中的应用范围仍不够广泛。此外，灵芝漆酶对XBR脱色率有待进一步提高，在以后实际应用方面还需要对漆酶进行固定化处理以方便回收再利用。
参考文献
[1] 钟平方，彭惠民，彭方毅，等.漆酶催化酚类、苯胺类化合物的动力学分析及其测定废水中邻苯二酚的应用研究[J].环境科学，2010，31（11）：2673-2677.
[2] CRISTVO RO，TAVARES APM，RIBEIRO AS，et al.Kinetic modelling and simulation of laccase catalyzed degradation of reactive textile dyes[J].Biores Tech，2008，99（11）：4768-4774.
[3] HAO J，SONG F，HUANG F.Production of laccase by a newly isolated deuteromycete fungus Pestalotiopsis sp. and its decolorization of azo dye[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2007，34（3）：233-240.
[4] BALDRIAN P.Fungal laccasesoccurrence and properties[J].FEMS Microbiology Reviews，2006，30：215-242.
[5] 何淼，况武，金祥福，等.蒽醌类染料废水处理的几种新技术[J].给水排水，2008，34（S1）：219-221.
[6] 王志新，施晓燕，蔡宇杰，等.白腐真菌SYBCL2漆酶的分离纯化及其在毛纺染料脱色中的应用[J].生物技术通报，2009（8）：156-161.
[7] 胡述浩，郭东会，朱启忠.真菌产漆酶对蒽醌类染料脱色的研究[J].资源开发与市场，2013，29（12）：1237-1238，1269.
[8] 孙秋芳，赵亮亮，李燕荣，等.漆酶/ABTS介质系统对蒽醌染料的脱色效果[J].贵州农业科学，2011，39（1）：190-193.
[9] 侯红漫，周集体，王竞，等.白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶对蒽醌染料SN4R脱色研究[J].大连理工大学学报，2004，44（5）：640-645.
[10] 朱林，洪宇植，方泽民，等.真菌漆酶对蒽醌和偶氮类活性染料的脱色[J].中国科技论文在线，2010，5（3）：224-227.
[11] 赵美丽.白腐菌产漆酶及其对印染污水处理的研究[D].南昌：南昌大学，2012.
[12] 张鹏.以ABTS为底物测定漆酶活力的方法[J].印染助剂，2007，24（1）：43-45.
关键词 灵芝漆酶；活性艳色蓝XBR；脱色
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）26-08875-03
Study on the Decolorized Condition on Reactive Brilliant Blue XBR by Laccase of Ganoderma lucidum
HAN Yehao， LING Qingzhi et al
（Medical College Anhui University of Science and Technology， Huainan， Anhui 232001； Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo， Zhejiang 315100）
Abstract [Objective] Decolorization of anthraquinone dye with laccase from Ganoderma lucidum was studied. [Method] Effects of different pH， dye concentrations， temperature， enzyme dosage， reaction time on decolorization of Reactive Brilliant Blue XBR were studied. [Result] The optimal conditions of decolorization are： pH 3.5， 40 ℃， 60 U/ml Ganoderma laccase and 200 mg/L dye concentration， respectively. Under the above conditions， the decolorization rate of Reactive Brilliant Blue XBR was 49% after 5 h catalyzation with the laccase from G. lucidum. [Conclusion] Ganoderma laccase under optimal conditions for Reactive Brilliant Blue XBR has a decolorization effect.
Key words Ganoderma lucidum； Reactive Brilliant Blue XBR； Decolorization
漆酶（E.C.1.10.3.2）是一类含铜的氧化还原酶，一般存在于真菌和植物中。它具有较大的应用价值，在造纸、纺织、食品等领域越来越受到人们的重视[1-4]。XBR是一种蒽醌类染料，为绿光蓝色粉末，染品色泽鲜艳，主要用于棉、粘胶、蚕丝等纤维的染色。蒽醌类染料的废水色度高，成分复杂，其芳香结构不易被破坏，可生化性差，脱色较慢，并且废水中含有有机染料，毒性强，pH波动大，组分变化大，是目前废水治理中的难点之一[5]。目前，利用漆酶对蒽醌类染料降解的研究日益受到关注[6-9]。朱林等[10]利用真菌5319产漆酶对蒽醌类和偶氮类染料进行了脱色研究，取得较好的效果。赵美丽[11]利用白腐真菌对印染类染料处理进行了研究，取得一定的效果。
笔者对灵芝漆酶对蒽醌类染料降解的条件进行优化，找出降解率较高的优化条件，提高降解效率，为灵芝漆酶降解蒽醌类染料研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种。灵芝（Ganoderma lucidum）菌种，由广西大学提供，浙江医药高等专科学校生物药物研究所保藏。
1.1.2 染料。
活性艳色蓝XBR（Reactive Brilliant Blue XBR）染料，由武汉三染染料有限公司提供。
1.1.3 化学试剂。
ABTS[2，2′连氮-二（3乙基苯并噻唑6磺酸）]，分析纯，Sigma 公司产品；醋酸、醋酸钠等试剂均为国产分析纯。
1.1.4 主要仪器。
冷冻离心机，Thermo公司；TU1810SPC紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器公司；酶标仪，Thermo 公司；BSA2245CW电子天平，Sartorius 公司；Starter 3C酸度计，奥豪斯（上海）公司；HH2数显恒温水浴锅，国华电器公司；Crystal ISRDH恒温振荡器，精骐仪器公司。
1.2 方法
1.2.1 粗酶液的制备。
采取常规法固体发酵灵芝，取固体发酵菌丝体，用研钵磨碎后按1∶10在蒸馏水中浸泡24 h，用8层纱布过滤，在12 000 r/min常温离心10 min，取上清液即为粗酶液。
1.2.2 漆酶酶活的测定。
灵芝漆酶酶活力定义：每分钟催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量为一个酶活力单位，单位以U/ml表示。根据文献[12]，以ABTS为底物的标准曲線法，先采用粗的灵芝漆酶与不同浓度的ABTS底物反应足够长的时间后，在420 nm处测定不同浓度ABTS自由基溶液对应的吸光值（A），绘制ABTS自由基浓度—吸光值曲线（图1）。 根据酶活力定义和图1，可以得到酶活力计算公式：
漆酶酶活力=1 000×[0.087×△A+0.002]×稀释倍数/△t
式中，酶活力单位为U/（mol·min）；△A为内反应前后吸光度变化差值；△t为反应时间。再用反应体系总体积 4 ml，包括0.5 ml 0.2 mol/L pH 4.5 醋酸-醋酸钠缓冲液、3 ml 0.5 mmol/L ABTS，其中ABTS由0.2 mol/L pH 4.5 醋酸-醋酸钠缓冲液溶解配制，0.5 ml 用缓冲液适当稀释的酶粗提液，测定反应的前 3 min内反应液在 420 nm 处吸光值OD的增加量，以灭活酶液做空白对照。试验重复3 次，取平均值，计算酶活力。
1.2.3 活性艳色蓝XBR吸收光谱的测定。
用 0.2 mol/L pH 3.5 醋酸-醋酸钠缓冲液配制200 mg/L活性艳色蓝XBR。测定时，稀释到线性范围内，以醋酸-醋酸钠缓冲液为空白对照，进行紫外波长扫描（图2），活性艳色蓝XBR的最大吸收峰在 600 nm 处。因此，研究中所有脱色率均以在600 nm处所测的吸光度OD值来计算。
1.2.4 染料脱色率的计算。
参照漆酶酶活检测体系设置4 ml 脱色反应体系。脱色体系中以 0.2 mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液配制活性艳色蓝XBR，最后加入灵芝漆酶粗酶液启动反应，在所需温度和条件下静置反应一段时间后，测定脱色反应后的溶液在 600 nm 处的吸光度。在相同试验条件下，加入等量 100 ℃灭活 10 min 的酶液作为空白对照，测定其吸光度，按以下公式计算不同脱色条件下的脱色率。
脱色率（%）=（A0-A1）/A0×100
式中，A0为醋酸-醋酸钠缓冲液添加染料在600 nm的OD值；A1为脱色反应后的OD值。试验重复3次，取平均值。
2 结果与分析
2.1 pH对灵芝漆酶粗酶液催化活性艳色蓝XBR脱色的影响
在脱色反应体系中，分别用 pH 为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 的0.2 mol/L 醋酸-醋酸钠为缓冲液，保持其他条件不变，对活性艳色蓝XBR进行脱色降解5 h。由图3可知，pH在3.5～4.5之间脱色效果较好，脱色率在35%以上；当 pH为 3.5 时，脱色率最高为41.53%。因此，确定其脱色最适pH为3.5。
2.2 染料浓度对灵芝漆酶粗酶液催化活性艳色蓝XBR脱色的影响
采用上述最适 pH 3.5、温度和漆酶用量，保持其他条件不变，分别对浓度为50、100、150、200、250、300、350 mg/L活性艳色蓝XBR进行脱色处理 2 h。由图4可知，随着染料浓度的增加，脱色率呈先升后降的趋势。当活性艳色蓝XBR的浓度为200 mg/时，脱色率最高，为48.78%。
入ABTS漆酶脱色率反而下降的现象一致。所以，加入
ABTS不利于灵芝漆酶对活性艳色蓝XBR脱色反应。另外，在最优条件下用恒温振荡器振荡反应，发现与静止反应区别不明显。
3 结论
研究表明，灵芝漆酶粗酶液对活性艳色蓝XBR具有一定的脱色效果，脱色的适宜條件为：pH 3.5、40 ℃、60 U/ml灵芝漆酶、200 mg/L染料浓度，此时蒽醌染料活性艳色蓝XBR脱色率可达49%左右。
虽然目前对漆酶降解染料污水的研究取得一定的进展，但由于染料污水情况复杂，漆酶在染料废水降解中的应用范围仍不够广泛。此外，灵芝漆酶对XBR脱色率有待进一步提高，在以后实际应用方面还需要对漆酶进行固定化处理以方便回收再利用。
参考文献
[1] 钟平方，彭惠民，彭方毅，等.漆酶催化酚类、苯胺类化合物的动力学分析及其测定废水中邻苯二酚的应用研究[J].环境科学，2010，31（11）：2673-2677.
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[3] HAO J，SONG F，HUANG F.Production of laccase by a newly isolated deuteromycete fungus Pestalotiopsis sp. and its decolorization of azo dye[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2007，34（3）：233-240.
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[5] 何淼，况武，金祥福，等.蒽醌类染料废水处理的几种新技术[J].给水排水，2008，34（S1）：219-221.
[6] 王志新，施晓燕，蔡宇杰，等.白腐真菌SYBCL2漆酶的分离纯化及其在毛纺染料脱色中的应用[J].生物技术通报，2009（8）：156-161.
[7] 胡述浩，郭东会，朱启忠.真菌产漆酶对蒽醌类染料脱色的研究[J].资源开发与市场，2013，29（12）：1237-1238，1269.
[8] 孙秋芳，赵亮亮，李燕荣，等.漆酶/ABTS介质系统对蒽醌染料的脱色效果[J].贵州农业科学，2011，39（1）：190-193.
[9] 侯红漫，周集体，王竞，等.白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶对蒽醌染料SN4R脱色研究[J].大连理工大学学报，2004，44（5）：640-645.
[10] 朱林，洪宇植，方泽民，等.真菌漆酶对蒽醌和偶氮类活性染料的脱色[J].中国科技论文在线，2010，5（3）：224-227.
[11] 赵美丽.白腐菌产漆酶及其对印染污水处理的研究[D].南昌：南昌大学，2012.
[12] 张鹏.以ABTS为底物测定漆酶活力的方法[J].印染助剂，2007，24（1）：43-45.