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[摘要]目的：探索阿托伐他汀对缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的作用。方法：制备脑缺血再灌注模型，用阿托伐他汀规律治疗，观察脑组织的通透性改变以及脑组织中基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达情况。湿重-干重法测量脑含水量的变化。结果：脑缺血再灌注提高了大鼠血脑屏障的通透性，用阿托伐他汀治疗后大鼠脑含水量明显降低，同时MMP-9表达减少。阿托伐他汀对血脑屏障具有保护作用。
[关键词]脑缺血再灌注 血脑屏障 基质金属蛋白酶9
中图分类号：R3文献标识码：A文章编号：1671－7597（2009）0310003－01
在临床中，常见的脑组织的病变例如脑肿瘤，脑缺血等病变都会影响到血脑屏障的通透性，致使血脑屏障对脑组织的保护作用受损，因此维护血脑屏障的结构和功能完整是当今神经保护研究中的热点，他汀类药物具有改善血管内皮功能，抗炎作用和免疫调节等作用，本试验主要是用阿托伐他汀干扰缺血再灌注模型的大鼠，来观察这种药物在病理情况下对基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达情况及对血脑屏障通透性的影响。
一、材料与方法
（一）实验动物
动物雄性SD大鼠，体重（200±20）g，由山西医科大学动物中心提供。实验前适应性饲养1周。随机分为缺血再灌注模型组和阿托伐他汀治疗组，各组内又按不同时间点分2h，4h，6h，12h，24h，48h小组，每小组10只。每小组中5只用于免疫组化试验，其余5只用于测定脑组织含水量。
（二）动物模型的制作
参照文献方法［1,2］，用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，常规消毒皮肤，颈部正中切开，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。沿颈内动脉向下分离出翼腭动脉，并电凝。用动脉夹夹闭颈总动脉，于颈内动脉上近颈总动脉向下分离出翼动脉，并电凝。用动脉夹夹闭颈总动脉，于颈内动脉上近颈总动脉分叉处剪一切口，将一鱼线（直径约0.30mm）沿颈内动脉缓慢插入至大脑中动脉口，略感阻力时停止，插入长度约（18.0±0.5）mm，结扎固定鱼线。结扎颈内动脉近心端，取下动脉夹，恢复颈外动脉血流。定时抽掉鱼线恢复灌注。
（三）观察指标
神经症状评分参照文献方法［3,4］，按受损程度拟定神经症状评分等级。无神经损伤症状为Ⅰ级；不能完全伸展左侧前爪为Ⅱ级；不能完全伸展左侧前爪，向左侧转圈为Ⅲ级；不能完全伸展左侧前爪，向左侧倾倒为Ⅳ级；不能自发行走，意识丧失为Ⅴ级。按上述标准，于造模后24h，采用单盲法对各组大鼠进行神经症状评分。
（四）阿托伐他汀规律治疗
在制作模型前一周，腹腔注射阿托伐他汀5毫克每千克每天。
（五）免疫组化法测定MMP-9的表达
石蜡切片常规脱蜡至水，3mL・L-1过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，热修复抗原后，100mL・L-1正常山羊血清封闭非特异性抗原滴加一抗（1∶100稀释）（购自武汉博士德生物公司），4℃过夜滴加生物素标记的二抗；37℃孵育30min；滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液；DAB显色，封片。
（六）脑组织称重
按照适当的时间点断头取脑，称重，（精确到0.1mg），然后置入100℃恒温箱，24h后称干重。脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100。
（七）数据处理
各测定值用.x ±s表示，用SPSS 10.0统计学软件作单因素方差分析。
二、结果
（一）免疫组化结果
大鼠在脑缺血再灌注4小时后，在脑组织中出现了MMP－9的表达，治疗组与模型组相比，每个时间点所得到的切片显示其阳性率明显下降（P <0.05）。
（二）脑组织含水量
本实验脑组织含水量在脑缺血后4小时增加（P <0.05），但治疗组增加的幅度比模型组的小。
三、结论
他汀类药物因与羟甲基戊二酰辅酶A结构相似，且与HMG2CoA还原酶的亲和力高出HMG2CoA数千倍，故可对该酶产生竞争性抑制作用。通过阻止从HMG2CoA合成甲羟戊酸，不但能有效调节血脂，而且还可通过抑制GTP结合蛋白Rho和Rac而上调内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）的表达，并作用于NADH/NADPH氧化酶系统，降低NADPH的氧化活性[5]。抑制低密度脂蛋白的氧化和降低细胞内的氧化强度，直接抑制超氧化物的产生并有效清除氧自由基，减轻内皮损伤。从而维持血脑屏障的完整性。但他汀类药物对MMP-9的影响至今尚未得到公认。
本试验显示脑缺血再灌注时。血脑屏障的完整性受损，脑组织水含量增加，但用阿托伐他汀治疗后，脑水肿得以缓解，同时MMP-9的表达明显下降，说明MMP-9的表达与脑水肿的发生密切相关，提示阿托伐他汀可通过降低血清MMP-9水平，减少血脑屏障的开放，减轻水肿，促进神经功能恢复，为ICH的治疗提供了一个新思路。
参考文献：
[1]Longa EZ,Weinstein PR,Carison S,et al.Reversible middle cer ebralartery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84.
[2]徐淑云、卞如濂、陈修，药理实验方法学，第3版[M].北京:人民卫生出版社，2002:1066.
[3]Lundy EF,Solik BS,Frank RS,et al.Morphometric evalu tion of braininfarcts in rats and gerbils[J].pharmacolmethods,1986,16(3):201.
[4]Bederson JB,Pitts LH,Germano SM,et al.Evaluation of 2,3,52triphe2 nyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats[J].stoke,1986,17:1304.
[5]Glorioso N,Troffa C, Filigheddu F,et al. Effect of the HMG2CoA reductase inhibitors on blood p ressure in patients with essential hypertension and p rimary hypercholesterolemia.Hypertension,1999,34:1281-1286.
[关键词]脑缺血再灌注 血脑屏障 基质金属蛋白酶9
中图分类号：R3文献标识码：A文章编号：1671－7597（2009）0310003－01
在临床中，常见的脑组织的病变例如脑肿瘤，脑缺血等病变都会影响到血脑屏障的通透性，致使血脑屏障对脑组织的保护作用受损，因此维护血脑屏障的结构和功能完整是当今神经保护研究中的热点，他汀类药物具有改善血管内皮功能，抗炎作用和免疫调节等作用，本试验主要是用阿托伐他汀干扰缺血再灌注模型的大鼠，来观察这种药物在病理情况下对基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达情况及对血脑屏障通透性的影响。
一、材料与方法
（一）实验动物
动物雄性SD大鼠，体重（200±20）g，由山西医科大学动物中心提供。实验前适应性饲养1周。随机分为缺血再灌注模型组和阿托伐他汀治疗组，各组内又按不同时间点分2h，4h，6h，12h，24h，48h小组，每小组10只。每小组中5只用于免疫组化试验，其余5只用于测定脑组织含水量。
（二）动物模型的制作
参照文献方法［1,2］，用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，常规消毒皮肤，颈部正中切开，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。沿颈内动脉向下分离出翼腭动脉，并电凝。用动脉夹夹闭颈总动脉，于颈内动脉上近颈总动脉向下分离出翼动脉，并电凝。用动脉夹夹闭颈总动脉，于颈内动脉上近颈总动脉分叉处剪一切口，将一鱼线（直径约0.30mm）沿颈内动脉缓慢插入至大脑中动脉口，略感阻力时停止，插入长度约（18.0±0.5）mm，结扎固定鱼线。结扎颈内动脉近心端，取下动脉夹，恢复颈外动脉血流。定时抽掉鱼线恢复灌注。
（三）观察指标
神经症状评分参照文献方法［3,4］，按受损程度拟定神经症状评分等级。无神经损伤症状为Ⅰ级；不能完全伸展左侧前爪为Ⅱ级；不能完全伸展左侧前爪，向左侧转圈为Ⅲ级；不能完全伸展左侧前爪，向左侧倾倒为Ⅳ级；不能自发行走，意识丧失为Ⅴ级。按上述标准，于造模后24h，采用单盲法对各组大鼠进行神经症状评分。
（四）阿托伐他汀规律治疗
在制作模型前一周，腹腔注射阿托伐他汀5毫克每千克每天。
（五）免疫组化法测定MMP-9的表达
石蜡切片常规脱蜡至水，3mL・L-1过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，热修复抗原后，100mL・L-1正常山羊血清封闭非特异性抗原滴加一抗（1∶100稀释）（购自武汉博士德生物公司），4℃过夜滴加生物素标记的二抗；37℃孵育30min；滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液；DAB显色，封片。
（六）脑组织称重
按照适当的时间点断头取脑，称重，（精确到0.1mg），然后置入100℃恒温箱，24h后称干重。脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100。
（七）数据处理
各测定值用.x ±s表示，用SPSS 10.0统计学软件作单因素方差分析。
二、结果
（一）免疫组化结果
大鼠在脑缺血再灌注4小时后，在脑组织中出现了MMP－9的表达，治疗组与模型组相比，每个时间点所得到的切片显示其阳性率明显下降（P <0.05）。
（二）脑组织含水量
本实验脑组织含水量在脑缺血后4小时增加（P <0.05），但治疗组增加的幅度比模型组的小。
三、结论
他汀类药物因与羟甲基戊二酰辅酶A结构相似，且与HMG2CoA还原酶的亲和力高出HMG2CoA数千倍，故可对该酶产生竞争性抑制作用。通过阻止从HMG2CoA合成甲羟戊酸，不但能有效调节血脂，而且还可通过抑制GTP结合蛋白Rho和Rac而上调内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）的表达，并作用于NADH/NADPH氧化酶系统，降低NADPH的氧化活性[5]。抑制低密度脂蛋白的氧化和降低细胞内的氧化强度，直接抑制超氧化物的产生并有效清除氧自由基，减轻内皮损伤。从而维持血脑屏障的完整性。但他汀类药物对MMP-9的影响至今尚未得到公认。
本试验显示脑缺血再灌注时。血脑屏障的完整性受损，脑组织水含量增加，但用阿托伐他汀治疗后，脑水肿得以缓解，同时MMP-9的表达明显下降，说明MMP-9的表达与脑水肿的发生密切相关，提示阿托伐他汀可通过降低血清MMP-9水平，减少血脑屏障的开放，减轻水肿，促进神经功能恢复，为ICH的治疗提供了一个新思路。
参考文献：
[1]Longa EZ,Weinstein PR,Carison S,et al.Reversible middle cer ebralartery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84.
[2]徐淑云、卞如濂、陈修，药理实验方法学，第3版[M].北京:人民卫生出版社，2002:1066.
[3]Lundy EF,Solik BS,Frank RS,et al.Morphometric evalu tion of braininfarcts in rats and gerbils[J].pharmacolmethods,1986,16(3):201.
[4]Bederson JB,Pitts LH,Germano SM,et al.Evaluation of 2,3,52triphe2 nyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats[J].stoke,1986,17:1304.
[5]Glorioso N,Troffa C, Filigheddu F,et al. Effect of the HMG2CoA reductase inhibitors on blood p ressure in patients with essential hypertension and p rimary hypercholesterolemia.Hypertension,1999,34:1281-1286.