【摘 要】
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为了寻找调控猪NADPH氧化酶1(NOX1)基因转录的转录因子,本研究采用3 \'端固定,5\'端逐渐截短的方法,扩增了NOX1基因的启动子区序列,并将它们分别连入双荧光素酶报告基因载体,转染PK15细胞后,检测双荧光素酶的相对活性.根据活性高低判定转录因子可能结合的位置,利用重叠PCR技术定点缺失转录因子的结合序列,再次连入报告载体后,根据荧光素酶活性的变化判定是否为NOX1基因真正的转录调控因子.结果 发现,NOX1基因启动子区的-1618～-1bp区间存在转录调控因子的结合位点,对该区间开展
【机 构】
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黑龙江省农业科学院,黑龙江哈尔滨150086;农业农村部种养结合重点实验室,黑龙江哈尔滨150086;黑龙江省农业科学院,黑龙江哈尔滨150086
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为了寻找调控猪NADPH氧化酶1(NOX1)基因转录的转录因子,本研究采用3 \'端固定,5\'端逐渐截短的方法,扩增了NOX1基因的启动子区序列,并将它们分别连入双荧光素酶报告基因载体,转染PK15细胞后,检测双荧光素酶的相对活性.根据活性高低判定转录因子可能结合的位置,利用重叠PCR技术定点缺失转录因子的结合序列,再次连入报告载体后,根据荧光素酶活性的变化判定是否为NOX1基因真正的转录调控因子.结果 发现,NOX1基因启动子区的-1618～-1bp区间存在转录调控因子的结合位点,对该区间开展2轮截短试验后,初步判定-1149～-1091 bp和-208～-115 bp区间存在正调控元件,-1091～-1052 bp区间存在负调控元件.针对上述3个区间,同时结合在线软件的预测结果,定向缺失了-1104～-1092 bp,-1051～-1043 bp,-1043～-1033 bp和-126～-116 bp小片段后,确定-1104～-1092bp和-126～-116 bp区间存在正调控该基因转录的元件结合位点,分别为ZNF384、ELF-1和TBR1.本研究克隆了猪NOX1基因的启动子序列,对可能结合到该区间的转录因子进行了筛选与分析,为后续分析NOX1的转录调控机制,探讨其生物学功能奠定了基础.
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