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摘要：为研究木薯中PHOR1基因如何被逆境信号调控，根据杨树2个PHOR1同源基因搜索木薯基因组数据库，得到2个高度同源的木薯PHOR1基因，即MePHOR1_1和MePHOR1_2。序列分析表明，它们都具有E3泛素连接酶家族成员特征：含有U-box和armadillo重复序列。此外其启动子区具有乙烯响应元件和茉莉酸响应元件。以木薯品种华南八号悬浮培养细胞为材料，利用qRT-PCR检测MePHOR1_1和MePHOR1_2基因在乙烯利和茉莉酸甲酯处理后的表达特性。结果显示：在乙烯和茉莉酸甲酯分别处理后的细胞悬浮液中，2个PHOR1基因的表达变化呈现相似趋势，即乙烯处理后，2个基因的表达均出现先下降后缓慢上升的趋势；而对茉莉酸信号则呈现先上升后下降又上升再下降的波动性趋势，故推测2个PHOR1基因可被乙烯和茉莉酸信号调控，并可在后续的根生长和淀粉积累等一系列生理生化过程中发挥作用。
关键词：木薯；PHOR1基因；乙烯；茉莉酸；表达分析
中图分类号：S533.01 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2016）11-0029-05
木薯（Manihot esculenta Crantz）属于大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot P.Miller），原产于热带南美洲，是世界三大薯类作物之一，是第六大粮食作物，是重要的能源和淀粉作物。木薯的根作为其主要经济部位，研究其生长发育和淀粉积累具有重要意义。
Amador等在研究马铃薯（Solanum tuberosum）短日照条件下在上调表达的调控因子中首次获得了PHOR1基因，并通过烟草转基因试验证明PHOR1对GA信号途径具有正调控作用[1]。PHOR1编码1个Cys-Pro-Ile motif（CPI）结构域和7个armadillo（ARM）重复序列的蛋白[2]。此CPI结构域具有典型的U-box序列特征，U-box结构一般存在于E3泛素连接酶中[3]，可促进特异目标蛋白的泛素化[4]，缺失试验表明，CPI是一种可被GA抑制的细胞质内滞留信号。而ARM重复序列是PHOR1的核定位信号，其核定位功能可为CPI所逆转。目前，对PHOR1基因的研究已有一定基础，但在木薯中的表达特性和基因功能还未被研究。
茉莉酸（jasmonic acid，簡称JA）和乙烯（ethylene，简称ET）是植物逆境响应的信号分子，在涉及植物对生物性和非生物性逆境胁迫和植物生长发育过程中的基因调控上发挥着重要作用。JA作为一种逆境胁迫转导信号，具有诱导植物防御基因的表达、调控植物对机械伤害、盐害及紫外线照射等非生物胁迫的反应的功能[5-6]。而ET是另外一种植物生长调节物质，可影响植物多个生长发育过程，对植物自身来说，乙烯在种子萌发、开花、叶片伸展、根的生长、果实成熟及器官衰老等方面发挥着作用；对植物与外界环境的关系来说，乙烯主要参与植物面对外界生物与非生物胁迫的反应过程。很多涉及上述相关过程的基因序列上都有乙烯响应元件[7-8]。
杨树中的PHOR1同源基因被发现具有调控芽和根生长、淀粉积累、木质部形成的功能[9]。根据杨树PHOR1同源基因PtPHOR1_1（POPTR_0007s03730）和PtPHOR1_2（POPTR_0005s05880）的序列在JGI的木薯基因组数据库 v6.1[10]中搜索获得2个高度同源序列：Manes.12G152200和Manes.13G071800，分别命名为MePHOR1_1和MePHOR1_2。生物信息学分析发现，其具有典型的U-box结构和ARM重复序列，且MePHOR1_1启动子区具有1个乙烯响应元件和1个茉莉酸响应元件，MePHOR1_2具有2个茉莉酸响应元件。同时利用木薯悬浮培养细胞对其ET和JA甲酯诱导表达特性分析中也发现，PHOR1基因可受ET和JA信号调控，并呈现不同的表达趋势。本研究旨在通过序列分析和表达分析，确定ET和JA信号是否能对PHOR1基因表达造成影响，并初步探索表达变化特性及其机制，为进一步研究逆境信号通过PHOR1基因在木薯块根发育和淀粉积累过程中所发挥的作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
木薯（Manihot esculenta Crantz）品种华南八号（SC8）悬浮培养细胞，该细胞通过叶片愈伤组织建立，保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所。Axygen总RNA小量制备试剂盒（Axygen）；PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反转录试剂盒（TaKaRa）；SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Pefect Real Time）实时定量试剂盒（TaKaRa）；引物由Invitrogen（上海）贸易有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 材料处理
吸取处于指数增长期的悬浮培养细胞 1 mL 于离心管中并置于摇床25 ℃稳定0.5 h，分为3组，其中2组分别以浓度为400 μL/L的乙烯利（ethephon）（Solarbio）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，简称MeJA）（Sigma-Aldrich）处理，另一组不进行任何处理作为对照。选取处理后0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h共5个时间点的样品，微离心后弃上清液氮速冻-80 ℃冰箱保存。此步骤重复3次，获得3批生物学重复。
1.2.2 PHOR1基因及启动子区序列分析
使用JGI的木薯基因组数据库（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias=Org_Mesculenta_er）获得MePHOR1_1和MePHOR1_2的CDS序列（coding sequence）和DNA序列（genomic sequence）[10]。用NetGene2 V2.4（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/）分析基因结构[11-12]。用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）分析内含子相位[13]。用TSSP（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=tssp
关键词：木薯；PHOR1基因；乙烯；茉莉酸；表达分析
中图分类号：S533.01 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2016）11-0029-05
木薯（Manihot esculenta Crantz）属于大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot P.Miller），原产于热带南美洲，是世界三大薯类作物之一，是第六大粮食作物，是重要的能源和淀粉作物。木薯的根作为其主要经济部位，研究其生长发育和淀粉积累具有重要意义。
Amador等在研究马铃薯（Solanum tuberosum）短日照条件下在上调表达的调控因子中首次获得了PHOR1基因，并通过烟草转基因试验证明PHOR1对GA信号途径具有正调控作用[1]。PHOR1编码1个Cys-Pro-Ile motif（CPI）结构域和7个armadillo（ARM）重复序列的蛋白[2]。此CPI结构域具有典型的U-box序列特征，U-box结构一般存在于E3泛素连接酶中[3]，可促进特异目标蛋白的泛素化[4]，缺失试验表明，CPI是一种可被GA抑制的细胞质内滞留信号。而ARM重复序列是PHOR1的核定位信号，其核定位功能可为CPI所逆转。目前，对PHOR1基因的研究已有一定基础，但在木薯中的表达特性和基因功能还未被研究。
茉莉酸（jasmonic acid，簡称JA）和乙烯（ethylene，简称ET）是植物逆境响应的信号分子，在涉及植物对生物性和非生物性逆境胁迫和植物生长发育过程中的基因调控上发挥着重要作用。JA作为一种逆境胁迫转导信号，具有诱导植物防御基因的表达、调控植物对机械伤害、盐害及紫外线照射等非生物胁迫的反应的功能[5-6]。而ET是另外一种植物生长调节物质，可影响植物多个生长发育过程，对植物自身来说，乙烯在种子萌发、开花、叶片伸展、根的生长、果实成熟及器官衰老等方面发挥着作用；对植物与外界环境的关系来说，乙烯主要参与植物面对外界生物与非生物胁迫的反应过程。很多涉及上述相关过程的基因序列上都有乙烯响应元件[7-8]。
杨树中的PHOR1同源基因被发现具有调控芽和根生长、淀粉积累、木质部形成的功能[9]。根据杨树PHOR1同源基因PtPHOR1_1（POPTR_0007s03730）和PtPHOR1_2（POPTR_0005s05880）的序列在JGI的木薯基因组数据库 v6.1[10]中搜索获得2个高度同源序列：Manes.12G152200和Manes.13G071800，分别命名为MePHOR1_1和MePHOR1_2。生物信息学分析发现，其具有典型的U-box结构和ARM重复序列，且MePHOR1_1启动子区具有1个乙烯响应元件和1个茉莉酸响应元件，MePHOR1_2具有2个茉莉酸响应元件。同时利用木薯悬浮培养细胞对其ET和JA甲酯诱导表达特性分析中也发现，PHOR1基因可受ET和JA信号调控，并呈现不同的表达趋势。本研究旨在通过序列分析和表达分析，确定ET和JA信号是否能对PHOR1基因表达造成影响，并初步探索表达变化特性及其机制，为进一步研究逆境信号通过PHOR1基因在木薯块根发育和淀粉积累过程中所发挥的作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
木薯（Manihot esculenta Crantz）品种华南八号（SC8）悬浮培养细胞，该细胞通过叶片愈伤组织建立，保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所。Axygen总RNA小量制备试剂盒（Axygen）；PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反转录试剂盒（TaKaRa）；SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Pefect Real Time）实时定量试剂盒（TaKaRa）；引物由Invitrogen（上海）贸易有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 材料处理
吸取处于指数增长期的悬浮培养细胞 1 mL 于离心管中并置于摇床25 ℃稳定0.5 h，分为3组，其中2组分别以浓度为400 μL/L的乙烯利（ethephon）（Solarbio）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，简称MeJA）（Sigma-Aldrich）处理，另一组不进行任何处理作为对照。选取处理后0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h共5个时间点的样品，微离心后弃上清液氮速冻-80 ℃冰箱保存。此步骤重复3次，获得3批生物学重复。
1.2.2 PHOR1基因及启动子区序列分析
使用JGI的木薯基因组数据库（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias=Org_Mesculenta_er）获得MePHOR1_1和MePHOR1_2的CDS序列（coding sequence）和DNA序列（genomic sequence）[10]。用NetGene2 V2.4（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/）分析基因结构[11-12]。用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）分析内含子相位[13]。用TSSP（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=tssp