作为一种新型科技产物,nano-TiO2被广泛应用于涂料、化妆品、水污染处理等行业。但是大量研究证明nano-TiO2对人体健康和环境存在着危害作用。nano-TiO2可刺激机体组织产生炎症反应,降低细胞活性,促进细胞凋亡,以及导致DNA损伤等。nano-TiO2具有纳米尺度效应、表面效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应、光催化效应。相对于大颗粒,nano-TiO2生物学效应的性质和强度也发生了质的变化。据目前研究发现,nano-TiO2对诱导损伤的发生机制主要跟炎症反应和氧化应激有关。铅是一种被普遍应用于电池、颜料、汽油、油漆、仪器中的有毒重金属。在环境中广泛存在,能够在生物体内蓄积。铅污染是当前国际社会特别突出的环境问题。铅污染导致DNA损伤和基因毒性,损伤人体神经、造血、生殖等系统。近来研究表明铅对诱导损伤的发生机制主要跟氧化应激有关。随着nano-TiO2的广泛使用,导致大量进入环境,特殊的表面效应使其极易与环境中的多种污染物结合。由于nano-TiO2的特殊理化性质,对环境中的金属离子或有机物具有很强的吸附能力。从而可能产生与其本身所致生物学效应的性质和强度不同的效应。pb2+广泛存在于环境当中,可吸附到nano-TiO2的表面,产生相互作用并共同作用于机体或环境。二者联合作用于机体可能导致的各种健康效应有何变化,至今尚无研究。环境中的nano-TiO2和其他污染物含量很低,一般都是痕量存在。在本研究中以低浓度nano-TiO2与环境常见污染物PbAc在无紫外条件下联合作用于体外培养的人类胚胎肝细胞(L02细胞)24hr,探究nano-TiO2与PbAc联合作用对细胞活性、ROS生成、还原性物质、DNA损伤、DNA修复酶表达、细胞凋亡等情况的影响,系统了解nano-TiO2与PbAc联合作用所致氧化应激和凋亡效应。本文在当前单独PbAc与nano-TiO2的毒理学作用机理研究基础上,探讨了二者之间的相互作用及可能的联合毒作用机制,为完善nano-TiO2的毒理学评价和了解环境中nano-TiO2与PbAc之间的健康效应提供理论基础和实验依据。本研究分为四个部分：第一部分nano-TiO2的团聚效应及其对PbAc的吸附作用研究目的：研究纳米二氧化钛(nano-TiO2)在溶液中的团聚作用及TiO2对醋酸铅(PbAc)的吸附作用。方法：采用纳米粒度仪检测0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的nano-TiO2在水溶液中团聚后粒度大小；石墨炉原子吸收(Graphite furnace atomic absorption spectrometry, GFAAS)检测0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的nano-TiO2对1μg/mL的PbAc吸附量的大小。结果：各浓度纳米二氧化钛团聚后粒度平均大小为298.8 nm,之间并无显著性差异(P>0.05)；相比较于单一的纳米二氧化钛红外图谱,混合物显示有醋酸基团被吸附于纳米二氧化钛；原子吸收结果显示0.001、0.01μg/mL TiO2吸附的PbAc量显著低于0.1、1、10μg/mL的TiO2 (P< 0.05);并且吸附量随TiO2浓度呈剂量依赖关系。结论：单一nano-TiO2在没有分散剂的作用下,短时间内在水溶液中有团聚；对PbAc有明显吸附作用,并且随nano-TiO2浓度的升高,吸附量增大。第二部分nano-TiO2与PbAc联合诱导人胚肝细胞氧化应激作用目的：观察nano-TiO2与PbAc单独及联合作用对人胚肝细胞(L02)活性、活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量及氧化应激的影响。方法：0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的nano-TiO2和1μg/mL的PbAc,以及0.001、0.01、0.1、1、10μg/mLnano-TiO2和1μg/mLPbAc的混合物(为了方便,在下面的描述中将TiO2和1μg/mL PbAc的混合物简写为10,1,0.1,0.01,0.001μg/mL混合物)联合作用于生长良好的L02细胞,二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO,1μL/mL)为阴性对照,将L02细胞染毒24hr后,以MTT法检测nano-TiO2与PbAc单独及联合作用对L02细胞活性的影响；运用DCFH-DA (2’,7’-dichlorofluorescin-diacetate)作为荧光探针,采用流式细胞检测技术检测nano-TiO2与PbAc联合作用下L02细胞内ROS含量,同时检测L02细胞内抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)的含量。结果：相比阴性对照、PbAc和其他单一TiO2剂量组,10μg/mL TiO2单独作用L02细胞24hr可显著降低细胞活性(P<0.05);1μg/mL TiO2相比阴性对照,导致显著性的细胞活性降低。与阴性对照相比,0.1、1、10μg/mL的混合物联合作用L02细胞24hr可引起细胞活性显著性降低(P<0.05)；与1μg/mL的PbAc单独作用相比,1、10μg/mL的混合物联合作用L02细胞24hr可引起细胞活性显著性降低(P<0.05)；所有浓度的nano-TiO2和1μg/mL的PbAc单独作用不能引起ROS、SOD、GSH水平的改变(P>0.05); 0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的混合物联合作用L02细胞24hr可引起ROS显著性增加(P<0.05)；单一TiO2和混合物所诱导的细胞毒性、ROS生成显示出剂量依赖关系。0.01、0.1、1μg/mL的混合物联合作用使细胞内GSH水平较阴性对照组有显著升高(P<0.05),并且1μg/mL的混合物联合作用使细胞内GSH水平较1μg/mL的PbAc单独作用有显著升高(P<0.05)；与阴性对照相比,0.01、0.1、μg/mL的混合物联合作用使细胞中抗氧化酶SOD活力显著性升高(P<0.05)；单一TiO2所诱导的GSH和SOD水平显示出剂量依赖关系。析因分析结果显示两种受试物混和染毒对细胞内细胞活性、ROS、GSH、SOD水平不存在交互协同作用(P>0.05)。结论：证明在低浓度无紫外的条件下,nano-TiO2和PbAc联合作用可增强细胞毒性、促进活性氧的产生和抗氧化物质应激性升高；nano-TiO2和PbAc联合作用可诱导细胞氧化应激,低浓度混合物作用时,上升的氧化应激触发了细胞保护防御的正调节作用,使细胞还拥有一定的抗氧化能力从而阻碍进一步的氧化损伤；而高浓度时,则触发了负调节作用,从而导致抗氧化能力下降。第三部分nano-TiO2与PbAc联合诱导人胚肝细胞DNA损伤及其对修复蛋白的影响研究目的：研究nano-TiO2与PbAc单独及联合作用对L02细胞活性、DNA损伤以及对OGGl (8-oxoguanine DNA glycosylase homolog 1)修复蛋白表达的影响。方法：0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的nano-TiO2和1μg/mL的PbAc,以及0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的混合物联合作用于生长良好的L02细胞,DMSO (1mL/L)为阴性对照,L02细胞处理时间为24 hr；运用碱性彗星试验和DNA氧化损伤标志物8-OHdG (8-Hydroxydeoxyguanosine)的含量检测各组DNA断裂损伤程度；运用western blot检测单独及联合作用对细胞DNA修复蛋白OGG1的影响。结果：相比阴性对照1μg/mL PbAc,10μg/mL混合物作用L02细胞24 hr可导致显著性升高的Olive尾距(Olive tail moment, OTM) (P< 0.05);相比阴性对照,1μg/mL混合物作用导致显著性升高的OTM(P<0.05)。所有浓度的nano-TiO2和1μg/mL的PbAc单独作用不能引起8-OHdG的含量和细胞DNA修复蛋白OGG1表达相对于阴性对照的显著性改变(P>0.05)；1、10μg/mL的混合物联合作用L02细胞导致8-OHdG的含量显著高于阴性对照组(P<0.05); 10μg/mL混合物联合作用导致8-OHdG的含量显著高于PbAc单独作用(P<0.05)。0.001、0.01、0.1、1μg/mL的混合物联合作用使细胞内DNA修复蛋白OGG1表达水平较阴性对照组和PbAc单独作用有显著升高(P<0.05)。单一TiO2和混合物所导致的OTM、8-OHdG生成显示出剂量依赖关系。但只有单一TiO2导致的OGG1表达显示出剂量依赖关系。析因分析结果显示两种受试物混和染毒对DNA损伤修复蛋白OGG1的表达存在交互协同作用(P<0.05)。结论：nano-TiO2和PbAc联合作用可增强L02细胞DNA损伤,同时协同增强调节DNA修复蛋白OGG1修复损伤的DNA,细胞还拥有一定的修复损伤DNA的能力。第四部分nano-TiO2与PbAc联合诱导人胚肝细胞凋亡效应研究目的：研究nano-TiO2与PbAc单独及联合作用对L02凋亡效应及对凋亡关键蛋白Caspase 3 (Cysteine-asparate protease 3)表达的影响。方法：0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的nano-TiO2和1μg/mL的PbAc,以及0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的混合物联合作用于生长良好的L02细胞,DMSO (1 mL/L)为阴性对照,L02细胞处理时间为24 hr；运用流式细胞仪检测nano-TiO2与PbAc单独及联合作用对L02早期和晚期凋亡的效应的影响；运用western blot检测单独及联合作用对细胞凋亡调控蛋白Caspase 3的影响。结果：单一1μg/mL的PbAc单独作用不能引起细胞早期凋亡水平相对于阴性对照的显著性改变(P>0.05); 1、10μg/mL的nano-TiO2导致细胞早期凋亡水平显著高于DMSO、PbAc以及0.001、0.01和0.1μg/mL nano-TiO2单独作用(P<0.05); 0.1μg/mL的nano-TiO2导致细胞早期凋亡水平显著高于DMSO、PbAc、0.001、0.01μg/mL nano-TiO2单独作用(P<0.05)；而所有的混合物均导致细胞早期凋亡水平显著高于DMSO阴性对照和PbAc单独作用(P<0.05)。所有浓度的nano-TiO2和1μg/mL的PbAc单独作用不能引起细胞晚期凋亡水平相对于阴性对照的显著性改变(P>0.05)。但是,10μg/mL的混合物联合作用使细胞晚期凋亡水平较DMSO阴性对照、PbAc单独作用和其他混合物作用有显著升高(P<0.05)。所有浓度的nano-TiO2和1μg/mL的PbAc单独作用不能引起细胞凋亡关键蛋白Caspase 3表达相对于阴性对照的显著性改变(P>0.05)。除了0.001μg/mL,所有混合物作用均导致细胞Caspase 3表达水平较DMSO阴性对照显著升高(P<0.05); 10μg/mL的混合物联合作用使细胞Caspase 3表达水平较DMSO阴性对照、PbAc单独作用和其他混合物作用有显著升高(P<0.05)。单一nano-TiO2和混合物所导致的细胞早晚期凋亡显示出剂量依赖关系。析因分析结果显示两种受试物混和染毒对晚期凋亡水平存在交互协同作用(P<0.05)。结论：nano-TiO2和PbAc联合作用可增强诱导L02增加细胞的凋亡,并协同增强细胞的晚期凋亡水平,而Caspase 3在细胞凋亡作用中起着关键作用。