【摘 要】
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目的 构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B并在猴肾成纤维细胞COS-7中稳定表达,分离纯化表达的重组融合蛋白,进行酶活性测定及抑制剂的初步实验.方
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目的 构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B并在猴肾成纤维细胞COS-7中稳定表达,分离纯化表达的重组融合蛋白,进行酶活性测定及抑制剂的初步实验.方法 应用RT-PCR从2型糖尿病患者的外周血总RNA中扩增出PTP1B cDNA全长序列,并在基因上下游分别引入BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ两个酶切位点,酶切后定向导入pcDNA3.1/Hismyc-B多克隆位点,构建真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B,转染COS-7细胞,G-418筛选2周后取细胞裂解上清液经Ni2+亲和层析柱纯化后,测定了其酶活性及小分子抑制剂钒酸钠的IC50.结果 从2型糖尿病患者外周血中扩增得到1 301 bpPTB1B cDNA全长序列,经双酶切鉴定及测序分析,表明hPTP1B已克隆到poDNA3.1/Hismyc-B中.RT-PCR和免疫印迹表明转染成功.酶活性实验初步显示rhPTP1B的活性随酶浓度增加而增加,随PTP1B的特异性抑制剂钒酸钠的浓度增加而减少.结论 获得具有酶活性的融合蛋白rhPTP1B,为进一步筛选其特异性抑制剂奠定基础.
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