论文部分内容阅读
摘要 [目的]研究高压静电场对紫花苜蓿组织培养的影响。[方法]利用电场处理紫花苜蓿的子叶和下胚轴，采用正交试验设计，设定3个水平，研究电场对外植体出愈率的影响。[结果]诱导愈伤组织的最佳浓度组合是1.8 mg/L 2，4D+0.3 mg/L 6BA；下胚轴在培养7 d后出愈率最高条件为频率3.85 kHz，场强2 kV/cm，时间20 min；20 d后，由于用20 min处理的下胚轴逐渐凋亡，因此下胚轴出愈率最高的条件为频率3.85 kHz，场强2 kV/cm，时间15 min。试验发现经电场处理后外植体木质化程度较高。[结论]高压静电场对紫花苜蓿组织培养具有一定影响。
关键词 电场；紫花苜蓿（Medicago sativa L）；组织培养；木质化；影响
中图分类号 S541+.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03182-04
Abstract [Objective] To study effects of electric field on alfalfa tissue culture. [Method] The cotyledon and hypocotyl of alfalfa is treated with electric field combined with tissue culture technology. We adopted the orthogonal experimental design and set up three levels， in order to study the influence of explant callus induction rate. [Result] The results indicated that the optimal concentration combination of callus induction is 2，4D： 1.8 mg/L， 6BA： 0.3 mg/L； the condition of the highest callus induction rate is frequency 3.85 kHz， field strength 2 kV/cm， time 20min after 7 days cultivation of hypocotyl. After 20 days， 20min treatment has promoted hypocotyl apoptosis， therefore the condition of the highest hypocotyl callus induction rate is frequency 3.85 kHz， field strength 2 kV/cm， time 15 min. In addition， we found that explant lignification degree is higher after electric field treatment. [Conclusion] Electric field has a certain effect on tissue culture of alfalfa.
Key words Electric field； Alfalfa； Tissue culture； Lignification； Effect
紫花苜蓿（Medicago sativa L）是多年生草本植物，是优良的牧草和生物能源物质，茎秆可以作为生物燃料，叶片可作为优质饲料、蛋白质添加剂等副产品，具有很高的综合利用价值，是一种很有潜力的土壤修复植物。但种子产量低，优良性状退化，在种子遗传转化率、氨基酸含量不均衡及耐盐性、抗病虫害等方面仍有待进一步提高。
静电生物效应研究最早、范围最广的领域是利用高压静电场处理植物的种子，提高种子活力，其研究的范围从经济作物到玉米、油葵等大田作物，药用植物到蔬菜、水果、微生物等。静电场处理种子的生物效应研究起源于半个世纪前，我国在60年代开始进行探索，到20世纪70年代，高压静电场的效应问题引起了越来越多人的注意[1-2]，到90年代开始大量的研究，主要探索经电场处理后的种子萌发率、幼苗生长抗旱性的变化并测定了种子萌发期和幼苗期的生理生化指标。根据报道，“经高压静电场处理后，种子的呼吸强度、根系活力、发芽率和发芽势均有所提高，禾苗长势好，整齐粗壮，抗病能力强，成熟早，产量也有不同程度的增加。种子在受到静电场的刺激下，种子蛋白发生凝聚，电导率降低，过氧化氢酶活性提高，三磷酸腺苷（ATP）含量提高，这些都有利于胚芽吸收和利用，遗传特性也得到了改善，增强了吸水能力，强化了基本营养物质迅速溶解和输送，萌发速度快，幼苗生长快而健壮[3-7]。有研究发现，静电场处理过的种子播种一天后吸收强度增强30%，10 d后增强70%～200%[8]。试验主要结合组织培养的优点，用电场处理外植体的子叶和下胚轴，最大可能的保留突变体植株，避免由于自然条件和自身因素的限制，突变细胞被大量淘汰而造成基因库的浪费。紫花苜蓿是异花授粉植物，自交结实率低，不到1%，杂交育种和杂种优势利用比较困难[9-11]，所以将生物技术与常规育种方法结合起来进行新品种培育，缩短育种年限，改良苜蓿品质，提高育种效率已是一个世界性的普遍趋势[12-13]，
因此，将诱变育种与组织培养相结合无疑是很有意义的。笔者主要探索电场对苜蓿愈伤组织培养的影响，结合离体培养技术分析经处理后的愈伤组织对苜蓿愈伤组织生长、分化的影响，以期为提高苜蓿转基因效率提供良好的突变体受体材料和试验参考数据，并为加快我国苜蓿的育种步伐奠定坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。选取籽粒饱满的准格尔苜蓿种子，由中国农科院草原研究所提供。 1.1.2 主要仪器。试验采用的电场是由2块直径60 cm圆形金属平板电极产生，两极板间距5 cm。放外植体的培养皿单层置于接地电极板上，调节2极板电场频率和电压设定处理条件；可调频高压电源，购自大连理工大学静电与特种电源研究所，可产生极板的电场频率和电压，可调频率范围为3.6～18.0 kHz。
1.2 方法
1.2.1 种子灭菌及无菌苗的制备。将苜蓿种子放入25 ml的三角瓶中，用浓度70%酒精浸泡2 min，弃掉酒精再加入浓度10%的次氯酸钠，浸泡45 min左右，期间摇晃数次，倒掉消毒液，随后用无菌水冲洗3～5次，最后在无菌水中浸泡3～4 h，把种子放在无菌滤纸上吸干多余的水分，置1/2MS（medium of Murashige and Skoog，2013）固体培养基上，光照强度为3 000 lx，16 h光照/8 h黑暗，温度（25±1） ℃。
1.2.2 外植体的处理。取7 d左右无菌苗的子叶和下胚轴，子叶被剪成四块，下胚轴剪成3～4 mm的小段，放到诱导愈伤组织的培养基上。
1.2.3 培养基的制备。（1）无菌苗培养基。1/2MS+浓度0.3%琼脂粉+15 g/L蔗糖。（2）诱导愈伤组织的培养基。1/2MS+浓度0.3%琼脂粉+15 g/L蔗糖，分别附加浓度分别为1.5、1.8和2.0 mg/的2，4D，以及浓度分别为0.3、0.5和1.0 mg/L的6BA，共9组不同浓度的组合。
1.2.4 胚性愈伤组织的培养。在超净台内，将子叶和下胚轴放在愈伤组织诱导培养基上，每个培养皿放20个外植体，子叶和下胚轴分别设2个重复，共36个培养皿，在培养基内培养15 d后，计数不同浓度组合下培养基上愈伤组织的数量，并将胚性愈伤组织转移到诱导胚状体的培养基上。
1.2.5 诱导胚状体的培养。设定2组培养基，1组为UM培养基+0.2 mg/L KT+2 g/L水解酪蛋白+0.3 mg/L 6BA+2.5 mg/L 2，4D；另1组为UM培养基+2 g/L水解酪蛋白+0.3 mg/L 6BA+2.5 mg/L 2，4D，研究KT对胚状体的发生与成熟的影响。在无菌条件下，用镊子将胚性愈伤组织掰成直径为2 mm的小块，然后再放到培养皿上，每个培养皿里放20块，培养36 d后，计数成熟胚状体的数量，再将成熟胚状体移到不含任何生长激素的1/2MS+0.3%琼脂粉+15 g/L蔗糖上，完成生根。
1.2.6 电场处理外植体。将子叶和下胚轴在无菌条件下放在愈伤组织诱导培养基上，每个培养皿放20个外植体，子叶和下胚轴分别设3个重复，共54个培养皿，1 080个外植体，取子叶和下胚轴各3个培养皿放在高压静电场的2平行极板间，其具体操作如图1。在培养基内培养7 d后，计数培养基上愈伤组织的数量，20 d后，计数胚性愈伤组织的数量，并将其转移到诱导胚状体的培养基上。
电场处理外植体后，出愈率明显提高，特别是在f=3.85 kHz，E=2 kV/cm，T=20 min时，下胚轴出愈率为91.4%，高于未处理的出愈率81.2%。并且电场处理后的外植体木质化程度加强，可能是促进木质素的沉积使细胞壁变得坚硬牢固，其具体原因需进一步去探讨。在后续的试验中，将会用不同激素浓度组合的培养基诱导胚状体，找出诱导分化率的最佳组合。因此，静电场对紫花苜蓿外植体的出愈率等均有刺激作用，但其作用机理仍有待今后继续研究。
参考文献
[1]
王秀文，王荣毅.静电高压场中植物生长的研究[C]//中国物理学会静电专业委员会学术及交流资料.北京：中国物理学会，1983：21-25.
[2] 叶家明.静电高压场对植物有丝分裂的影响[C]//中国物理学会静电生物效应在农业上的应用学术交流资料.北京：中国物理学会，1984：76-77.
[3] 宋占海.静电场处理作物种子对其活力的影响及机理初探[J].种子， 1993（1）： 43-46.
[4] 王莘，李肃华，闵伟红，等.高压静电场对月见草种子萌发期的生物学效应[J].生物物理学报， 1997，13（4）：668-670.
[5] 吴旭红，孙为民，张红燕，等.高压静电场对南瓜种子萌发及幼苗生长的生物学效应[J].种子，2004，23（2）：27-30.
[6] 王清元，卢贵忠，赵玉清.高压静电场对水稻种子萌发的试验研究[J].云南农业大学学报，2005，20（1）：147-150.
[7] 邓红梅，韩寒冰，熊建平.高压静电场对黄瓜种子萌发期生理指标的影响[J].武汉植物学研究，2006，24（1）：87-89.
[8] 白希尧，马文田，刘慎言，等.静电技术在农业中的应用[J].自然杂志， 1984，7（12）： 902-906.
[9] 姜彦成，党荣理.植物资源学[M].乌鲁木齐：新疆人民出版社， 2002：165-166.
[10] 闵继淳，肖凤.新疆当家草种紫花苜蓿生产有关问题[J].新疆畜牧业， 1986（S1）：79-82.
[11] 姚爱兴.苜蓿组织培养研究进展[J].宁夏农学院学报， 1991，12（1）：60-64.
[12] 张秀海.植物抗旱基因工程研究进展[J].生物技术通报，2001（4）：21-25.
[13] CROUGHAN T P，STAVAREK S J，RAINS D W.Selection of a NaCl Tolerant Line of Cultured Alfalfa Cells[J]. Crop Science， 1978，18：959-963.
关键词 电场；紫花苜蓿（Medicago sativa L）；组织培养；木质化；影响
中图分类号 S541+.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03182-04
Abstract [Objective] To study effects of electric field on alfalfa tissue culture. [Method] The cotyledon and hypocotyl of alfalfa is treated with electric field combined with tissue culture technology. We adopted the orthogonal experimental design and set up three levels， in order to study the influence of explant callus induction rate. [Result] The results indicated that the optimal concentration combination of callus induction is 2，4D： 1.8 mg/L， 6BA： 0.3 mg/L； the condition of the highest callus induction rate is frequency 3.85 kHz， field strength 2 kV/cm， time 20min after 7 days cultivation of hypocotyl. After 20 days， 20min treatment has promoted hypocotyl apoptosis， therefore the condition of the highest hypocotyl callus induction rate is frequency 3.85 kHz， field strength 2 kV/cm， time 15 min. In addition， we found that explant lignification degree is higher after electric field treatment. [Conclusion] Electric field has a certain effect on tissue culture of alfalfa.
Key words Electric field； Alfalfa； Tissue culture； Lignification； Effect
紫花苜蓿（Medicago sativa L）是多年生草本植物，是优良的牧草和生物能源物质，茎秆可以作为生物燃料，叶片可作为优质饲料、蛋白质添加剂等副产品，具有很高的综合利用价值，是一种很有潜力的土壤修复植物。但种子产量低，优良性状退化，在种子遗传转化率、氨基酸含量不均衡及耐盐性、抗病虫害等方面仍有待进一步提高。
静电生物效应研究最早、范围最广的领域是利用高压静电场处理植物的种子，提高种子活力，其研究的范围从经济作物到玉米、油葵等大田作物，药用植物到蔬菜、水果、微生物等。静电场处理种子的生物效应研究起源于半个世纪前，我国在60年代开始进行探索，到20世纪70年代，高压静电场的效应问题引起了越来越多人的注意[1-2]，到90年代开始大量的研究，主要探索经电场处理后的种子萌发率、幼苗生长抗旱性的变化并测定了种子萌发期和幼苗期的生理生化指标。根据报道，“经高压静电场处理后，种子的呼吸强度、根系活力、发芽率和发芽势均有所提高，禾苗长势好，整齐粗壮，抗病能力强，成熟早，产量也有不同程度的增加。种子在受到静电场的刺激下，种子蛋白发生凝聚，电导率降低，过氧化氢酶活性提高，三磷酸腺苷（ATP）含量提高，这些都有利于胚芽吸收和利用，遗传特性也得到了改善，增强了吸水能力，强化了基本营养物质迅速溶解和输送，萌发速度快，幼苗生长快而健壮[3-7]。有研究发现，静电场处理过的种子播种一天后吸收强度增强30%，10 d后增强70%～200%[8]。试验主要结合组织培养的优点，用电场处理外植体的子叶和下胚轴，最大可能的保留突变体植株，避免由于自然条件和自身因素的限制，突变细胞被大量淘汰而造成基因库的浪费。紫花苜蓿是异花授粉植物，自交结实率低，不到1%，杂交育种和杂种优势利用比较困难[9-11]，所以将生物技术与常规育种方法结合起来进行新品种培育，缩短育种年限，改良苜蓿品质，提高育种效率已是一个世界性的普遍趋势[12-13]，
因此，将诱变育种与组织培养相结合无疑是很有意义的。笔者主要探索电场对苜蓿愈伤组织培养的影响，结合离体培养技术分析经处理后的愈伤组织对苜蓿愈伤组织生长、分化的影响，以期为提高苜蓿转基因效率提供良好的突变体受体材料和试验参考数据，并为加快我国苜蓿的育种步伐奠定坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。选取籽粒饱满的准格尔苜蓿种子，由中国农科院草原研究所提供。 1.1.2 主要仪器。试验采用的电场是由2块直径60 cm圆形金属平板电极产生，两极板间距5 cm。放外植体的培养皿单层置于接地电极板上，调节2极板电场频率和电压设定处理条件；可调频高压电源，购自大连理工大学静电与特种电源研究所，可产生极板的电场频率和电压，可调频率范围为3.6～18.0 kHz。
1.2 方法
1.2.1 种子灭菌及无菌苗的制备。将苜蓿种子放入25 ml的三角瓶中，用浓度70%酒精浸泡2 min，弃掉酒精再加入浓度10%的次氯酸钠，浸泡45 min左右，期间摇晃数次，倒掉消毒液，随后用无菌水冲洗3～5次，最后在无菌水中浸泡3～4 h，把种子放在无菌滤纸上吸干多余的水分，置1/2MS（medium of Murashige and Skoog，2013）固体培养基上，光照强度为3 000 lx，16 h光照/8 h黑暗，温度（25±1） ℃。
1.2.2 外植体的处理。取7 d左右无菌苗的子叶和下胚轴，子叶被剪成四块，下胚轴剪成3～4 mm的小段，放到诱导愈伤组织的培养基上。
1.2.3 培养基的制备。（1）无菌苗培养基。1/2MS+浓度0.3%琼脂粉+15 g/L蔗糖。（2）诱导愈伤组织的培养基。1/2MS+浓度0.3%琼脂粉+15 g/L蔗糖，分别附加浓度分别为1.5、1.8和2.0 mg/的2，4D，以及浓度分别为0.3、0.5和1.0 mg/L的6BA，共9组不同浓度的组合。
1.2.4 胚性愈伤组织的培养。在超净台内，将子叶和下胚轴放在愈伤组织诱导培养基上，每个培养皿放20个外植体，子叶和下胚轴分别设2个重复，共36个培养皿，在培养基内培养15 d后，计数不同浓度组合下培养基上愈伤组织的数量，并将胚性愈伤组织转移到诱导胚状体的培养基上。
1.2.5 诱导胚状体的培养。设定2组培养基，1组为UM培养基+0.2 mg/L KT+2 g/L水解酪蛋白+0.3 mg/L 6BA+2.5 mg/L 2，4D；另1组为UM培养基+2 g/L水解酪蛋白+0.3 mg/L 6BA+2.5 mg/L 2，4D，研究KT对胚状体的发生与成熟的影响。在无菌条件下，用镊子将胚性愈伤组织掰成直径为2 mm的小块，然后再放到培养皿上，每个培养皿里放20块，培养36 d后，计数成熟胚状体的数量，再将成熟胚状体移到不含任何生长激素的1/2MS+0.3%琼脂粉+15 g/L蔗糖上，完成生根。
1.2.6 电场处理外植体。将子叶和下胚轴在无菌条件下放在愈伤组织诱导培养基上，每个培养皿放20个外植体，子叶和下胚轴分别设3个重复，共54个培养皿，1 080个外植体，取子叶和下胚轴各3个培养皿放在高压静电场的2平行极板间，其具体操作如图1。在培养基内培养7 d后，计数培养基上愈伤组织的数量，20 d后，计数胚性愈伤组织的数量，并将其转移到诱导胚状体的培养基上。
电场处理外植体后，出愈率明显提高，特别是在f=3.85 kHz，E=2 kV/cm，T=20 min时，下胚轴出愈率为91.4%，高于未处理的出愈率81.2%。并且电场处理后的外植体木质化程度加强，可能是促进木质素的沉积使细胞壁变得坚硬牢固，其具体原因需进一步去探讨。在后续的试验中，将会用不同激素浓度组合的培养基诱导胚状体，找出诱导分化率的最佳组合。因此，静电场对紫花苜蓿外植体的出愈率等均有刺激作用，但其作用机理仍有待今后继续研究。
参考文献
[1]
王秀文，王荣毅.静电高压场中植物生长的研究[C]//中国物理学会静电专业委员会学术及交流资料.北京：中国物理学会，1983：21-25.
[2] 叶家明.静电高压场对植物有丝分裂的影响[C]//中国物理学会静电生物效应在农业上的应用学术交流资料.北京：中国物理学会，1984：76-77.
[3] 宋占海.静电场处理作物种子对其活力的影响及机理初探[J].种子， 1993（1）： 43-46.
[4] 王莘，李肃华，闵伟红，等.高压静电场对月见草种子萌发期的生物学效应[J].生物物理学报， 1997，13（4）：668-670.
[5] 吴旭红，孙为民，张红燕，等.高压静电场对南瓜种子萌发及幼苗生长的生物学效应[J].种子，2004，23（2）：27-30.
[6] 王清元，卢贵忠，赵玉清.高压静电场对水稻种子萌发的试验研究[J].云南农业大学学报，2005，20（1）：147-150.
[7] 邓红梅，韩寒冰，熊建平.高压静电场对黄瓜种子萌发期生理指标的影响[J].武汉植物学研究，2006，24（1）：87-89.
[8] 白希尧，马文田，刘慎言，等.静电技术在农业中的应用[J].自然杂志， 1984，7（12）： 902-906.
[9] 姜彦成，党荣理.植物资源学[M].乌鲁木齐：新疆人民出版社， 2002：165-166.
[10] 闵继淳，肖凤.新疆当家草种紫花苜蓿生产有关问题[J].新疆畜牧业， 1986（S1）：79-82.
[11] 姚爱兴.苜蓿组织培养研究进展[J].宁夏农学院学报， 1991，12（1）：60-64.
[12] 张秀海.植物抗旱基因工程研究进展[J].生物技术通报，2001（4）：21-25.
[13] CROUGHAN T P，STAVAREK S J，RAINS D W.Selection of a NaCl Tolerant Line of Cultured Alfalfa Cells[J]. Crop Science， 1978，18：959-963.