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摘要[目的]提高丙酸杆菌代谢物的抑菌活性，为薛氏丙酸杆菌代谢物的工业化生产奠定基础。[方法]以实验室保藏的薛氏丙酸杆菌H1310为出发菌株，采用亚硝基胍（NTG）进行诱变处理，待突变菌株长出后采用双层平板筛选法进行筛选，而后通过深层液体发酵对筛选到的菌株进行复筛。[结果]当最优的NTG诱变浓度为0.3 mg/mL时，致死率为90.69%。采用双层平板法，从3 564株菌落中挑选出87株突变株，进一步进行复筛，获得一株突变菌株，其代谢物抑菌活性达（28.30±2.47） AU/mL，比出发菌株提高43.87%。[结论]确定了丙酸杆菌NTG诱变选育的试验方法，获得一株抑菌活性高的遗传性能稳定的菌株。
关键词亚硝基胍诱变；薛氏丙酸杆菌；双层平板筛选法；抑菌活性
中图分类号S188+.4文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）02-018-03
Abstract [Objective] To improve the antibacterial activity of the metabolite of Propionibacterium shermanii and lay a foundation for the industrial production of the metabolite.[Method] This research used Propionibacterium shermanii H1310 as the original strain，through nitrosoguanidine（NTG） mutagenesis，using the doublelayer plate screening method to screen the mutant strains.The strains which were surrounded by clear inhibition zone were cultivated and measured the antibacterial activity.[Result] The optimal concentration of NTG was 0.3 mg/mL，for the lethality rate was 90.69%.87 strains chosen from 3 564 strains were fermented again.A high antibacterial metabolites stain NTG110605 was selected and its antibacterial activity reached （28.30±2.47） AU/ mL，which was 43.87% higher than the original strain.[Conclusion] The experimental methods of mutation breeding of Propionibacterium shermanii is confirmed and a strain which produced more antibacterial substances is obtained.
Key wordsNitrosoguanidine mutation； Propionibacterium shermanii； Doublelayers plate screening method； Antibacterial activity
丙酸杆菌是一种厌氧或兼性厌氧的革兰氏阳性细菌，广泛存在于土壤、奶酪、牛奶、奶制品以及青贮饲料中[1]。一部分经典丙酸杆菌在生长代谢过程中可产生乙酸、丙酸、二乙酰、过氧化氢及丙酸杆菌素等物质。这些物质的协同作用可以抑制部分微生物的生长[2]。最为常见的丙酸杆菌代谢物MicrogardTM系列产品由薛氏丙酸杆菌在脱脂乳中发酵而成，可抑制部分革兰氏阴性细菌、霉菌和酵母[3]。此外，美国食品药品监督总局已批准丙酸杆菌代谢物MicrogardTM作为防腐剂应用于奶酪和酸奶制品中。据悉，在美国约30%的奶酪中含有MicrogardTM[4]。在实际工业生产中，丙酸杆菌代谢物抑菌活性较低。
在微生物发酵过程中，提高代谢物产量较常见的方法有优化发酵条件[5]、优化发酵培养基[6]、菌株诱变选育、基因定点突变等[7-8]。孙帅等[9]在丙酸杆菌发酵第4天起每24 h补加一次复合碳源和酵母粉，发现试验组发酵液抑菌活性显著高于对照组。Gollop等[10]发现在丙酸杆菌P127生长过程中，培养基中碳源、乳酸钠、琼脂的初始浓度以及培养基的初始pH都是丙酸杆菌素PLG1生产的影响因素。刘靖等[11]采用紫外和亚硝基胍诱变最终选育出丙酸杆菌素高产菌株。Zhang等[12]采用基因重排提高薛氏丙酸杆菌产VB12的能力，最终突变菌株产量与亲本菌株相比提高了60%。目前，国内关于丙酸杆菌的菌株选育工作还处于实验室研究阶段，并不能满足丙酸杆菌代谢物工业化生产的需求。自1928年Fleming发现野生青霉菌以来，经过反复多次诱变育种，青霉素产量近100 000 U/mL，与野生菌株相比提升了上万倍[13-15]。在工业微生物育种中，诱变选育目的菌株作为一种常见的实验方法被广泛地应用于改善菌种特性、提高工业菌株代谢物产量[16]。根据所使用的诱变剂类别，诱变育种可分为物理诱变、化学诱变、生物诱变[17]。大部分的诱变方式都可导致基因碱基位点的缺失、增加、转移、替代或DNA链的断裂。其中，最有效的诱变方法包括亚硝基胍诱变、甲基甲硫磺酸盐诱变、紫外诱变等。2007年付学琴等[18]对产南昌霉素菌株进行NTG诱变，发现筛选得到的突变株产量比出发菌株提高116.7%。
亚硝基胍（NTG）是一种烷基化物，在高pH环境下裂解产生重氮甲烷。一些研究表明，NTG介导的诱变引起细胞内DNA分子中碱基对G/C转换成A/T。此外，NTG还会引发碱基对A/T转换成C/G[19]。影响NTG诱变的因素包括缓冲液的pH、NTG浓度等。一些研究表明，在菌株诱变选育过程中，当致死率为80.0%～90.0%时正突变菌株较多，当致死率在90.0%～99.9%时负突变菌株较多[20]。 笔者以NTG作为诱变剂，对出发菌株——薛氏丙酸杆菌进行诱变育种，以期得到一株代谢物抑菌活性更高的突变株，为丙酸杆菌育种及其代谢物工业化生产奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌株。薛氏丙酸杆菌H1310（Propionibacterium shermanii H1310）和指示菌恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）均为实验室保藏菌种。
1.1.2培养基。丙酸杆菌种子培养基（SLB）组成为：胰蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、乳酸钠10 g/L、KH2PO4 0.25 g/L、MnSO4 0.005 g/L，将pH调至7.0。丙酸杆菌发酵培养基组成为：葡萄糖15 g/L、酵母膏15 g/L、乳酸钠6 mL/L、KH2PO4 0.25 g/L、MnSO4 0.005 g/L，将pH调至7.0。LB培养基组成为：胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、氯化钠10 g/L，将pH调至7.0。以上3种培养基均在121 ℃下灭菌20 min。
1.1.3主要试剂。亚硝基胍，购自生工生物有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2试验方法
1.2.1出发菌株活化。取含有丙酸杆菌菌粉的安碚管，在无菌条件下敲碎安碚管，用少量SLB培养基溶解菌粉，转入新鲜SLB培养基中，在30 ℃静置培养48 h后制备终浓度为20%的甘油管，-80 ℃保存。
1.2.2出发菌株生长曲线的测定。将活化后的薛氏丙酸杆菌以1%接种量转入SLB培养基中，每组3个平行，30 ℃静置培养，每12 h取样测定OD600nm，绘制丙酸杆菌生长曲线。
1.2.3菌悬液的制备。丙酸杆菌于30 ℃静置培养至对数生长期（OD600nm=1.2～1.5），8 000 r/min离心10 min，去除上清，用浓度0.85%无菌生理盐水洗涤3次，最后菌体用TM缓冲液（pH8.0）重悬，且将菌体浓度调整为108 CFU/mL，备用。
1.2.4NTG诱变。以丙酮作为助溶剂，用pH 8.0的Tris顺丁烯二酸（TM）缓冲液配制成终浓度为1.0 mg/mL的NTG母液。各取500 μl菌悬液分装于6个EP管中，分别添加不同体积的NTG母液和TM缓冲液使得各EP管反应液总体积为1 mL，且每管中NTG浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，在30 ℃下200 r/min振荡反应30 min后加入大量生理盐水以终止反应。将诱变后的菌液10倍梯度稀释并涂布，每组设置3个平行，30 ℃下厌氧培养7 d[13]。
1.2.5致死率的测定。将经涂布的平板培养7 d后进行菌落计数，并且计算致死率。
1.2.6突变菌株初筛。采用双层平板初筛法测定。取过夜培养的恶臭假单胞菌菌液，并且稀释至OD600nm为0.2，备用。在3 mL pH为5.3的LB软琼脂培养基（琼脂含量0.75%）中加入0.1 mL上述菌液，迅速混匀后倒在长有丙酸杆菌单菌落的平板上，铺平。在30 ℃静置培养12 h，待指示菌菌膜形成后，比较不同菌落产生抑菌圈的大小。
1.2.7突变菌株复筛。将抑菌圈较明显的菌落接入种子培养基中，30 ℃静置培养2 d后按5%接种量接入发酵培养基中，最后30 ℃静置培养4 d后测定抑菌活性。
1.2.8突变菌株与出发菌株的比较。分别取突变菌株和出发菌株的甘油管，连续传代稳定后，以5%接种量接入发酵培养基中，每隔24 h取样，测定生物量、抑菌活性。
1.2.9抑菌活性测定。采用改良的临界稀释法[14]测定。向96孔板每孔中加入20 μL不同稀释浓度的丙酸杆菌代谢物和180 μL稀释指示菌菌液。以180 μL稀释菌液和20 μL无菌LB培养基为阳性对照，以200 μL LB培养基为空白对照。每个稀释度的样品做3个平行。在37 ℃培养箱中静置培养3～5 h， 在波长600 nm处测吸光值。吸光值为阳性对照一半的发酵液的稀释倍数记为抑菌活性，单位AU/mL。
2结果与分析
2.1种子生长曲线由图1可知，在出发菌株接种后0～12 h内OD600nm几乎无变化，在接种后36～48 h内丙酸杆菌种子液OD600nm急剧增加，菌体代谢旺盛，处于对数期，此时对丙酸杆菌进行诱变处理效果较好。
2.2NTG浓度对丙酸杆菌致死率的影响由图2可知，丙酸杆菌对NTG比较敏感，当NTG浓度为0.1 mg/mL时致死率已达到62.20%，随着NTG添加量的增大，致死率不断增加，当体系中NTG浓度为0.4 mg/mL时致死率达98.07%。
2.3突变菌株筛选方法的建立
采用“1.2.6”的双层平板法进行菌株筛选。图3中菌落A在菌膜覆盖后四周出现抑菌圈，菌落B在菌膜覆盖后四周没有出现抑菌圈。抑菌圈的出现表明单菌落抑菌活性的增加。NTG诱变后通过菌膜覆盖初筛的方法就可能迅速找到提高抑菌活性的单菌落。这是一个简单、快速的初筛方法。
2.4双层平板筛选方法的验证
NTG诱变后筛选出38株有明显抑菌圈的菌株，进行进一步的发酵。经测定，出发菌株抑菌活性平均值为（19.90±0.97）AU/mL，复筛菌株抑菌活性平均值为（23.27±3.62）AU/mL，可见复筛菌株抑菌活性在0.05水平显著高于出发菌株。同时，对突变菌株进行统计。由表1可知，与出发菌株
相比，有
22株菌的抑菌活性提高10%以上，为正突变，有5
株菌的抑菌活性降低10%以上，为负突变，有11株菌的抑菌活性与出发菌株相差小于±10%。在筛选到的菌株中，正突变占57.89%，负突变占13.16%，而且通过初筛筛选的菌株抑菌活性确实高于对照，表明这一初筛方法是快速、有效的。 2.5丙酸杆菌筛选结果
从3 564个单菌落中挑出87株突变菌，进行抑菌活力的检测。由图4可知，突变菌株中抑菌活性高于
出发菌株的共有59株，其中代谢物抑菌活性高于30 AU/mL的菌株有5株，抑菌活性分别达到31.28、30.38、31.68、32.43、32.43 AU/mL，分别比出发菌株提高了56.87%、52.35%、58.87%、62.63%、62.63%。
2.6突变菌株与出发菌株的比较
由图5可知，发酵进行至第6天突变菌株NTG110605代谢物抑菌活性明显高于出发菌株，抑菌活性最高达（28.30±2.47）AU/mL，比出发菌株提高43.87%，差异在0.05水平显著。
2.7突变菌株遗传稳定性
菌株NTG110605连续传代5次，检测每代菌株发酵上清液的抑菌活性。由图6可知，经过5次传代后的菌株NTG110605发酵上清液的抑菌活性变化不大，维持在30 AU/mL左右。可见，菌株NTG110605的遗传稳定性良好。
3结论与讨论
该研究首次将双层平板筛选法应用在丙酸杆菌菌株筛选方面，利用丙酸杆菌代谢物抑菌的特点，在丙酸杆菌单菌落上覆盖指示菌菌膜，挑选有抑菌圈的菌落进行复筛，并且验证了双层平板筛选方法的可行性。
丙酸杆菌NTG诱变育种的试验方法为：选取活化48 h的丙酸杆菌种子液，进行NTG诱变（NTG浓度0.3 mg/mL，缓冲液pH 8.0），作用30 min，培养7 d后在菌落上反覆盖指示菌菌膜，挑选四周有抑菌圈菌落进行螺口三角瓶复筛，根据复筛结果选择高产菌株。通过5轮传代验证，最终得到一株遗传稳定的突变菌株NTG110605，其抑菌活性达28.30 AU/mL，高于出发菌株43.87%。笔者通过NTG诱变，最终得到一株高抑菌活性的菌株，为后续丙酸杆菌代谢物工业化生产奠定基础。
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关键词亚硝基胍诱变；薛氏丙酸杆菌；双层平板筛选法；抑菌活性
中图分类号S188+.4文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）02-018-03
Abstract [Objective] To improve the antibacterial activity of the metabolite of Propionibacterium shermanii and lay a foundation for the industrial production of the metabolite.[Method] This research used Propionibacterium shermanii H1310 as the original strain，through nitrosoguanidine（NTG） mutagenesis，using the doublelayer plate screening method to screen the mutant strains.The strains which were surrounded by clear inhibition zone were cultivated and measured the antibacterial activity.[Result] The optimal concentration of NTG was 0.3 mg/mL，for the lethality rate was 90.69%.87 strains chosen from 3 564 strains were fermented again.A high antibacterial metabolites stain NTG110605 was selected and its antibacterial activity reached （28.30±2.47） AU/ mL，which was 43.87% higher than the original strain.[Conclusion] The experimental methods of mutation breeding of Propionibacterium shermanii is confirmed and a strain which produced more antibacterial substances is obtained.
Key wordsNitrosoguanidine mutation； Propionibacterium shermanii； Doublelayers plate screening method； Antibacterial activity
丙酸杆菌是一种厌氧或兼性厌氧的革兰氏阳性细菌，广泛存在于土壤、奶酪、牛奶、奶制品以及青贮饲料中[1]。一部分经典丙酸杆菌在生长代谢过程中可产生乙酸、丙酸、二乙酰、过氧化氢及丙酸杆菌素等物质。这些物质的协同作用可以抑制部分微生物的生长[2]。最为常见的丙酸杆菌代谢物MicrogardTM系列产品由薛氏丙酸杆菌在脱脂乳中发酵而成，可抑制部分革兰氏阴性细菌、霉菌和酵母[3]。此外，美国食品药品监督总局已批准丙酸杆菌代谢物MicrogardTM作为防腐剂应用于奶酪和酸奶制品中。据悉，在美国约30%的奶酪中含有MicrogardTM[4]。在实际工业生产中，丙酸杆菌代谢物抑菌活性较低。
在微生物发酵过程中，提高代谢物产量较常见的方法有优化发酵条件[5]、优化发酵培养基[6]、菌株诱变选育、基因定点突变等[7-8]。孙帅等[9]在丙酸杆菌发酵第4天起每24 h补加一次复合碳源和酵母粉，发现试验组发酵液抑菌活性显著高于对照组。Gollop等[10]发现在丙酸杆菌P127生长过程中，培养基中碳源、乳酸钠、琼脂的初始浓度以及培养基的初始pH都是丙酸杆菌素PLG1生产的影响因素。刘靖等[11]采用紫外和亚硝基胍诱变最终选育出丙酸杆菌素高产菌株。Zhang等[12]采用基因重排提高薛氏丙酸杆菌产VB12的能力，最终突变菌株产量与亲本菌株相比提高了60%。目前，国内关于丙酸杆菌的菌株选育工作还处于实验室研究阶段，并不能满足丙酸杆菌代谢物工业化生产的需求。自1928年Fleming发现野生青霉菌以来，经过反复多次诱变育种，青霉素产量近100 000 U/mL，与野生菌株相比提升了上万倍[13-15]。在工业微生物育种中，诱变选育目的菌株作为一种常见的实验方法被广泛地应用于改善菌种特性、提高工业菌株代谢物产量[16]。根据所使用的诱变剂类别，诱变育种可分为物理诱变、化学诱变、生物诱变[17]。大部分的诱变方式都可导致基因碱基位点的缺失、增加、转移、替代或DNA链的断裂。其中，最有效的诱变方法包括亚硝基胍诱变、甲基甲硫磺酸盐诱变、紫外诱变等。2007年付学琴等[18]对产南昌霉素菌株进行NTG诱变，发现筛选得到的突变株产量比出发菌株提高116.7%。
亚硝基胍（NTG）是一种烷基化物，在高pH环境下裂解产生重氮甲烷。一些研究表明，NTG介导的诱变引起细胞内DNA分子中碱基对G/C转换成A/T。此外，NTG还会引发碱基对A/T转换成C/G[19]。影响NTG诱变的因素包括缓冲液的pH、NTG浓度等。一些研究表明，在菌株诱变选育过程中，当致死率为80.0%～90.0%时正突变菌株较多，当致死率在90.0%～99.9%时负突变菌株较多[20]。 笔者以NTG作为诱变剂，对出发菌株——薛氏丙酸杆菌进行诱变育种，以期得到一株代谢物抑菌活性更高的突变株，为丙酸杆菌育种及其代谢物工业化生产奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌株。薛氏丙酸杆菌H1310（Propionibacterium shermanii H1310）和指示菌恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）均为实验室保藏菌种。
1.1.2培养基。丙酸杆菌种子培养基（SLB）组成为：胰蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、乳酸钠10 g/L、KH2PO4 0.25 g/L、MnSO4 0.005 g/L，将pH调至7.0。丙酸杆菌发酵培养基组成为：葡萄糖15 g/L、酵母膏15 g/L、乳酸钠6 mL/L、KH2PO4 0.25 g/L、MnSO4 0.005 g/L，将pH调至7.0。LB培养基组成为：胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、氯化钠10 g/L，将pH调至7.0。以上3种培养基均在121 ℃下灭菌20 min。
1.1.3主要试剂。亚硝基胍，购自生工生物有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2试验方法
1.2.1出发菌株活化。取含有丙酸杆菌菌粉的安碚管，在无菌条件下敲碎安碚管，用少量SLB培养基溶解菌粉，转入新鲜SLB培养基中，在30 ℃静置培养48 h后制备终浓度为20%的甘油管，-80 ℃保存。
1.2.2出发菌株生长曲线的测定。将活化后的薛氏丙酸杆菌以1%接种量转入SLB培养基中，每组3个平行，30 ℃静置培养，每12 h取样测定OD600nm，绘制丙酸杆菌生长曲线。
1.2.3菌悬液的制备。丙酸杆菌于30 ℃静置培养至对数生长期（OD600nm=1.2～1.5），8 000 r/min离心10 min，去除上清，用浓度0.85%无菌生理盐水洗涤3次，最后菌体用TM缓冲液（pH8.0）重悬，且将菌体浓度调整为108 CFU/mL，备用。
1.2.4NTG诱变。以丙酮作为助溶剂，用pH 8.0的Tris顺丁烯二酸（TM）缓冲液配制成终浓度为1.0 mg/mL的NTG母液。各取500 μl菌悬液分装于6个EP管中，分别添加不同体积的NTG母液和TM缓冲液使得各EP管反应液总体积为1 mL，且每管中NTG浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，在30 ℃下200 r/min振荡反应30 min后加入大量生理盐水以终止反应。将诱变后的菌液10倍梯度稀释并涂布，每组设置3个平行，30 ℃下厌氧培养7 d[13]。
1.2.5致死率的测定。将经涂布的平板培养7 d后进行菌落计数，并且计算致死率。
1.2.6突变菌株初筛。采用双层平板初筛法测定。取过夜培养的恶臭假单胞菌菌液，并且稀释至OD600nm为0.2，备用。在3 mL pH为5.3的LB软琼脂培养基（琼脂含量0.75%）中加入0.1 mL上述菌液，迅速混匀后倒在长有丙酸杆菌单菌落的平板上，铺平。在30 ℃静置培养12 h，待指示菌菌膜形成后，比较不同菌落产生抑菌圈的大小。
1.2.7突变菌株复筛。将抑菌圈较明显的菌落接入种子培养基中，30 ℃静置培养2 d后按5%接种量接入发酵培养基中，最后30 ℃静置培养4 d后测定抑菌活性。
1.2.8突变菌株与出发菌株的比较。分别取突变菌株和出发菌株的甘油管，连续传代稳定后，以5%接种量接入发酵培养基中，每隔24 h取样，测定生物量、抑菌活性。
1.2.9抑菌活性测定。采用改良的临界稀释法[14]测定。向96孔板每孔中加入20 μL不同稀释浓度的丙酸杆菌代谢物和180 μL稀释指示菌菌液。以180 μL稀释菌液和20 μL无菌LB培养基为阳性对照，以200 μL LB培养基为空白对照。每个稀释度的样品做3个平行。在37 ℃培养箱中静置培养3～5 h， 在波长600 nm处测吸光值。吸光值为阳性对照一半的发酵液的稀释倍数记为抑菌活性，单位AU/mL。
2结果与分析
2.1种子生长曲线由图1可知，在出发菌株接种后0～12 h内OD600nm几乎无变化，在接种后36～48 h内丙酸杆菌种子液OD600nm急剧增加，菌体代谢旺盛，处于对数期，此时对丙酸杆菌进行诱变处理效果较好。
2.2NTG浓度对丙酸杆菌致死率的影响由图2可知，丙酸杆菌对NTG比较敏感，当NTG浓度为0.1 mg/mL时致死率已达到62.20%，随着NTG添加量的增大，致死率不断增加，当体系中NTG浓度为0.4 mg/mL时致死率达98.07%。
2.3突变菌株筛选方法的建立
采用“1.2.6”的双层平板法进行菌株筛选。图3中菌落A在菌膜覆盖后四周出现抑菌圈，菌落B在菌膜覆盖后四周没有出现抑菌圈。抑菌圈的出现表明单菌落抑菌活性的增加。NTG诱变后通过菌膜覆盖初筛的方法就可能迅速找到提高抑菌活性的单菌落。这是一个简单、快速的初筛方法。
2.4双层平板筛选方法的验证
NTG诱变后筛选出38株有明显抑菌圈的菌株，进行进一步的发酵。经测定，出发菌株抑菌活性平均值为（19.90±0.97）AU/mL，复筛菌株抑菌活性平均值为（23.27±3.62）AU/mL，可见复筛菌株抑菌活性在0.05水平显著高于出发菌株。同时，对突变菌株进行统计。由表1可知，与出发菌株
相比，有
22株菌的抑菌活性提高10%以上，为正突变，有5
株菌的抑菌活性降低10%以上，为负突变，有11株菌的抑菌活性与出发菌株相差小于±10%。在筛选到的菌株中，正突变占57.89%，负突变占13.16%，而且通过初筛筛选的菌株抑菌活性确实高于对照，表明这一初筛方法是快速、有效的。 2.5丙酸杆菌筛选结果
从3 564个单菌落中挑出87株突变菌，进行抑菌活力的检测。由图4可知，突变菌株中抑菌活性高于
出发菌株的共有59株，其中代谢物抑菌活性高于30 AU/mL的菌株有5株，抑菌活性分别达到31.28、30.38、31.68、32.43、32.43 AU/mL，分别比出发菌株提高了56.87%、52.35%、58.87%、62.63%、62.63%。
2.6突变菌株与出发菌株的比较
由图5可知，发酵进行至第6天突变菌株NTG110605代谢物抑菌活性明显高于出发菌株，抑菌活性最高达（28.30±2.47）AU/mL，比出发菌株提高43.87%，差异在0.05水平显著。
2.7突变菌株遗传稳定性
菌株NTG110605连续传代5次，检测每代菌株发酵上清液的抑菌活性。由图6可知，经过5次传代后的菌株NTG110605发酵上清液的抑菌活性变化不大，维持在30 AU/mL左右。可见，菌株NTG110605的遗传稳定性良好。
3结论与讨论
该研究首次将双层平板筛选法应用在丙酸杆菌菌株筛选方面，利用丙酸杆菌代谢物抑菌的特点，在丙酸杆菌单菌落上覆盖指示菌菌膜，挑选有抑菌圈的菌落进行复筛，并且验证了双层平板筛选方法的可行性。
丙酸杆菌NTG诱变育种的试验方法为：选取活化48 h的丙酸杆菌种子液，进行NTG诱变（NTG浓度0.3 mg/mL，缓冲液pH 8.0），作用30 min，培养7 d后在菌落上反覆盖指示菌菌膜，挑选四周有抑菌圈菌落进行螺口三角瓶复筛，根据复筛结果选择高产菌株。通过5轮传代验证，最终得到一株遗传稳定的突变菌株NTG110605，其抑菌活性达28.30 AU/mL，高于出发菌株43.87%。笔者通过NTG诱变，最终得到一株高抑菌活性的菌株，为后续丙酸杆菌代谢物工业化生产奠定基础。
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