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【摘要】目的 研究翼状胬肉组织中NF-κB/P65蛋白的表达量及其与微血管密度的相关性分析。方法 收集15例原发性翼状胬肉组织标本及5例对照组结膜组织标本，免疫组织化学检测胬肉及正常结膜组织内微血管密度、NF-κB/P65蛋白的表达，并探讨NF-κB/P65蛋白与微血管密度的相关性。结果 15例原发性翼状胬肉中NF-κB/P65表达率为86.76%，平均计分为5.20±2.96，与结膜组织中表达具有统计学差异（P=0.030）。NF-κB/P65与微血管密度有较高的正相关性（P=0.0005）。结论 NF-kB表达的上调可能导致了血管形成相关细胞生长因子、黏附因子的上调和抗血管生成机制的减弱，参与了原发性翼状胬肉中的血管生成。
【关键词】翼状胬肉；NF-κB/P65；微血管密度
【中图分类号】R-0【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2014）08-0375-01
原发性翼状胬肉是位于眼表的纤维血管增生性疾病，其病因尚不十分清楚。由于翼状胬肉组织的头部侵入角膜基质层引起牵拉造成了角膜散光，术后并不能很好改善，甚至有可能加重，以及术后美容等问题均未得到很好的解决。有研究发现翼状胬肉患者角膜中央上皮细胞减少而杯状细胞和树突状细胞增多，其与翼状胬肉的临床分级密切相关，而这一过程受到免疫机制及脉管系统的参与和调控[1]。NF-κB作为核转录因子，广泛存在于各种细胞内。研究显示NF-κB能与细胞凋亡所必需的许多细胞因子的基因启动子或增强子部位的kB位点发生特异性结合，从而启动和调节这些基因的转录，在组织血管新生中发挥重要作用。目前尚未见到关于NF-κB和翼状胬肉新生血管的相关性的研究。
1 材料与方法
1.1病例选择 本实验所收集标本均来自武汉大学中南医院门诊及住院部患者。病例临床资料均完整，且均已于术前告知患者并获得患者知情同意。
1.2主要试剂 兔抗人NF-κB/P65多克隆抗体、兔抗人CD34多克隆抗体（购自武汉博士德公司）；SABC免疫组织化学染色试剂盒、DAB试剂盒和Poly-L-Lysine(10x) 多聚赖氨酸购自福州迈新公司。
1.3标本处理15例翼状胬肉组织标本和5例结膜松弛症患者的结膜组织标本均于术中取得，经5%的生理盐水充分漂洗后，固定于4%的多聚甲醛溶液中48小时。甲苯透明10分钟后，浸于60℃的石蜡中15分钟后包埋、冷却后待实验时使用。
1.4组织形态学观察 将已固定好的组织标本进行石蜡包埋、切片（片厚4μm）、苏木精－伊红（HE）染色、免疫组织化学染色，显微镜观察并拍照，观察胬肉及正常结膜组织内微血管密度、NF-κB/P65蛋白的表达及空间分布。
1.5 统计学分析所有计数资料最终以率（百分数）表示。均采用SPSS19.0统计软件进行分析，相关性分析用Pearson直线相关分析，以P<0.05为有统计学差异。
2 结果
2.1 NF-κB/P65在翼状胬肉组织及结膜组织中的表达差异以细胞核内黄染或棕黄染计为NF-κB/P65表达阳性：实验组上皮层和基质层均有不同程度的阳性表达，并且小血管内皮细胞出现核黄染现象，阳性表达率为86.67%，平均评分为5.20±2.96。对照球结膜组上皮层只有1例阳性表达，基质层有2例阳性表达，阳性表达率为40%，平均评分为1.80±1.10（如表-1）。两组计分差别缺乏统计学差异（采用两独立样本的Mann-Whitney检验，U=13.00，P=0.030）。
2.2 NF-κB/P65与微血管密度相关性分析经Pearson相关性分析发现实验组中NF-κB与其微血管密度具有一定的相关性。rNF-κB=0.787，P=0.0005（如表-2所示）(采用Pearson相关性检验)
表-1 NF-κB/P65在实验组和对照组球结膜中的的表达情况
例数 - + 阳性率（%）
实验组 15 2 13 86.67
对照组 5 3 2 40.00
表-2 实验组各标本NF-κB及微血管密度情况
N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均
NF-κB 6 3 1 1 9 6 7 8 5 8 2 3 9 8 2 5.20±2.96
MVD 14 9 10 11 16 11 13 14 12 13 11 13 14 17 10 12.53±2.26
3 讨论
翼状胬肉表现为局部球结膜纤维血管组织呈三角形增生并侵犯角膜。近年来新生血管的调节机制成为翼状胬肉研究的热点之一。早在1989年Hill和Maske就提出，新生血管形成可能参与翼状胬肉的发生与发展过程。NF-κB是可与免疫球蛋白中轻链基因增强子KB序列(GGGACTTTCC)特异结合并促使K链基因转录的核蛋白因子。NF-κB的P65亚基上的锚定蛋白重复序列与抑制蛋白(inhibitory kappa B, IκB)结合，当细胞受到来自细胞外的刺激时，信号由细胞表面受体介导，将信号转化到IkB激酶(IκB kinase，IκK)上。随即IκK发生磷酸化，激活的IκK复合物将IκB（特别是IκBα）中丝氨酸残短磷酸化，磷酸化的IκB随之在E3-SCFβ-TrCp蛋白复合物作用下泛素化，进一步被26S蛋白酶小体降解[2]。从NF-κB-IκBs复合物上解离出的NF-κB从核孔进入细胞核，与顺式作用元件结合后调控如细胞因子、生长因子、转录因子等的编码基因转录，从而影响细胞的生长分化、细胞凋亡等生物学过程[3]。本实验通过免疫组织化学法对翼状胬肉组织中NF-κB蛋白的含量进行了半定量检测，发现通过NF-κB通路的激活，诱导下游如TNFα, IL-2, IL-6, VCAM-1和 u-PA等因子合成增强，影响基质酶活性以及受体与其配体间的相互作用，完成纤维结缔组织的重构，从而促进新生血管的管腔形成。
参考文献：
[1]宋寅伟，蔡小军.翼状胬肉新生血管形成机制及其治疗的研究进展.中华实验眼科杂志，2012,30(2):172-175
[2]唐惠玲. NF-κB信号传导与疾病研究进展. 黑龙江医药科学，2012 (05):34-36.
[3]袁洪峰, 贺翔鸽. 核因子-κB与眼科疾病的研究进展. 国际眼科杂志. 2008(01): 132-6.
通讯作者：张虹
【关键词】翼状胬肉；NF-κB/P65；微血管密度
【中图分类号】R-0【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2014）08-0375-01
原发性翼状胬肉是位于眼表的纤维血管增生性疾病，其病因尚不十分清楚。由于翼状胬肉组织的头部侵入角膜基质层引起牵拉造成了角膜散光，术后并不能很好改善，甚至有可能加重，以及术后美容等问题均未得到很好的解决。有研究发现翼状胬肉患者角膜中央上皮细胞减少而杯状细胞和树突状细胞增多，其与翼状胬肉的临床分级密切相关，而这一过程受到免疫机制及脉管系统的参与和调控[1]。NF-κB作为核转录因子，广泛存在于各种细胞内。研究显示NF-κB能与细胞凋亡所必需的许多细胞因子的基因启动子或增强子部位的kB位点发生特异性结合，从而启动和调节这些基因的转录，在组织血管新生中发挥重要作用。目前尚未见到关于NF-κB和翼状胬肉新生血管的相关性的研究。
1 材料与方法
1.1病例选择 本实验所收集标本均来自武汉大学中南医院门诊及住院部患者。病例临床资料均完整，且均已于术前告知患者并获得患者知情同意。
1.2主要试剂 兔抗人NF-κB/P65多克隆抗体、兔抗人CD34多克隆抗体（购自武汉博士德公司）；SABC免疫组织化学染色试剂盒、DAB试剂盒和Poly-L-Lysine(10x) 多聚赖氨酸购自福州迈新公司。
1.3标本处理15例翼状胬肉组织标本和5例结膜松弛症患者的结膜组织标本均于术中取得，经5%的生理盐水充分漂洗后，固定于4%的多聚甲醛溶液中48小时。甲苯透明10分钟后，浸于60℃的石蜡中15分钟后包埋、冷却后待实验时使用。
1.4组织形态学观察 将已固定好的组织标本进行石蜡包埋、切片（片厚4μm）、苏木精－伊红（HE）染色、免疫组织化学染色，显微镜观察并拍照，观察胬肉及正常结膜组织内微血管密度、NF-κB/P65蛋白的表达及空间分布。
1.5 统计学分析所有计数资料最终以率（百分数）表示。均采用SPSS19.0统计软件进行分析，相关性分析用Pearson直线相关分析，以P<0.05为有统计学差异。
2 结果
2.1 NF-κB/P65在翼状胬肉组织及结膜组织中的表达差异以细胞核内黄染或棕黄染计为NF-κB/P65表达阳性：实验组上皮层和基质层均有不同程度的阳性表达，并且小血管内皮细胞出现核黄染现象，阳性表达率为86.67%，平均评分为5.20±2.96。对照球结膜组上皮层只有1例阳性表达，基质层有2例阳性表达，阳性表达率为40%，平均评分为1.80±1.10（如表-1）。两组计分差别缺乏统计学差异（采用两独立样本的Mann-Whitney检验，U=13.00，P=0.030）。
2.2 NF-κB/P65与微血管密度相关性分析经Pearson相关性分析发现实验组中NF-κB与其微血管密度具有一定的相关性。rNF-κB=0.787，P=0.0005（如表-2所示）(采用Pearson相关性检验)
表-1 NF-κB/P65在实验组和对照组球结膜中的的表达情况
例数 - + 阳性率（%）
实验组 15 2 13 86.67
对照组 5 3 2 40.00
表-2 实验组各标本NF-κB及微血管密度情况
N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均
NF-κB 6 3 1 1 9 6 7 8 5 8 2 3 9 8 2 5.20±2.96
MVD 14 9 10 11 16 11 13 14 12 13 11 13 14 17 10 12.53±2.26
3 讨论
翼状胬肉表现为局部球结膜纤维血管组织呈三角形增生并侵犯角膜。近年来新生血管的调节机制成为翼状胬肉研究的热点之一。早在1989年Hill和Maske就提出，新生血管形成可能参与翼状胬肉的发生与发展过程。NF-κB是可与免疫球蛋白中轻链基因增强子KB序列(GGGACTTTCC)特异结合并促使K链基因转录的核蛋白因子。NF-κB的P65亚基上的锚定蛋白重复序列与抑制蛋白(inhibitory kappa B, IκB)结合，当细胞受到来自细胞外的刺激时，信号由细胞表面受体介导，将信号转化到IkB激酶(IκB kinase，IκK)上。随即IκK发生磷酸化，激活的IκK复合物将IκB（特别是IκBα）中丝氨酸残短磷酸化，磷酸化的IκB随之在E3-SCFβ-TrCp蛋白复合物作用下泛素化，进一步被26S蛋白酶小体降解[2]。从NF-κB-IκBs复合物上解离出的NF-κB从核孔进入细胞核，与顺式作用元件结合后调控如细胞因子、生长因子、转录因子等的编码基因转录，从而影响细胞的生长分化、细胞凋亡等生物学过程[3]。本实验通过免疫组织化学法对翼状胬肉组织中NF-κB蛋白的含量进行了半定量检测，发现通过NF-κB通路的激活，诱导下游如TNFα, IL-2, IL-6, VCAM-1和 u-PA等因子合成增强，影响基质酶活性以及受体与其配体间的相互作用，完成纤维结缔组织的重构，从而促进新生血管的管腔形成。
参考文献：
[1]宋寅伟，蔡小军.翼状胬肉新生血管形成机制及其治疗的研究进展.中华实验眼科杂志，2012,30(2):172-175
[2]唐惠玲. NF-κB信号传导与疾病研究进展. 黑龙江医药科学，2012 (05):34-36.
[3]袁洪峰, 贺翔鸽. 核因子-κB与眼科疾病的研究进展. 国际眼科杂志. 2008(01): 132-6.
通讯作者：张虹