目的 利用RNA干扰(RNAi)技术将针对性构建的重组质粒转染入人肺癌细胞株NCI-H520,观察下调Pokemon基因对人肺癌细胞生物学行为的影响.方法 利用Ambion公司设计软件设计针对Pokemon基因的2条小干扰RNA(siRNA)序列,并合成2对互补的siRNA编码DNA片段,定向克隆至RNAi-Ready pSIREN-RetroQ载体的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ位点,构建重组体质粒,分别命名为pSIREN-Pokemon-1和pSIREN-Pokemon-2,同时设立转染空载体对照组.Western blot检测人肺癌细胞中Pokemon蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色实验检测转染后细胞的增殖抑制结果,流式细胞分析技术检测转染后细胞周期的分布.结果 利用RNAi-Ready pSIRENR RetroQ载体构建的重组质粒可以成功抑制人肺癌细胞NCI-H520中Pokemon蛋白的表达.Western blot检测发现人肺癌细胞NCI-H520中Pokemon蛋白高水平表达,转染后其表达水平明显下降.转染后第3天,MTT比色实验显示pSIREN-Pokemon-1组(0.001 5 ±0.003 0)和pSIREN-Pokemon-2组(0.0086±0.0015)与pSIREN-Pokemon-0组(0.023 0 ±0.001 0)比较差异有统计学意义(P＜0.05),而pSIREN-Pokemon-1与pSIREN-Pokemon-2组之间差异无统计学意义(P＞0.05).流式细胞分析检测发现转染siRNA细胞与转染空载体细胞的细胞周期差异无统计学意义(P＞0.05).pSIREN-Pokemon-1转染组及pSIREN-Pokemon-2转染组形成克隆的数量(18.0±0.3、16.0±0.4)明显低于pSIREN-Pokemon-0组(52.0±0.4,P＜0.05).结论 使用pSIREN载体成功构建的重组质粒转染人肺癌细胞可有效抑制原癌基因Pokemon的表达.转染后细胞增殖受到抑制,生长速度减慢.抑制Pokemon蛋白表达对细胞周期无明显影响.靶向siRNA可以在人肺癌细胞中抑制Pokemon蛋白表达,负调节肺癌细胞生长。
抑制Pokemon蛋白表达对人肺癌细胞株NCI-H520的作用
【摘 要】
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目的 利用RNA干扰(RNAi)技术将针对性构建的重组质粒转染入人肺癌细胞株NCI-H520,观察下调Pokemon基因对人肺癌细胞生物学行为的影响.方法 利用Ambion公司设计软件设计针对Pokemon基因的2条小干扰RNA(siRNA)序列,并合成2对互补的siRNA编码DNA片段,定向克隆至RNAi-Ready pSIREN-RetroQ载体的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ位点,构建重组体质粒
【机 构】
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450052郑州大学第五附属医院呼吸科,郑州大学第一附属医院病理科,450052郑州大学第五附属医院呼吸科
【出 处】
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中华实验外科杂志
【发表日期】
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2014年31期
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