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[摘要] 用光谱法研究了蛇床子素与脱氧核糖核酸的相互作用，结果表明，在最大发射波长408 nm处，脱氧核糖核酸能显著地猝灭蛇床子素的荧光信号。在pH=5.5时，信号猝灭的强度△F最大，并且体系的荧光强度与DNA浓度在10～40 nmol/L范围内呈良好的线性关系。
[关键词] 蛇床子素；脱氧核糖核酸；相互作用
[中圖分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）07-33-02
近年来，由于天然植物有效成分被广泛应用于生物制品、药物等领域[1]，天然植物的活性成分与DNA的相互作用的研究受到了广泛关注，蛇床子素与DNA结合作用研究还未见到。因此本文采用荧光光谱法，探讨了蛇床子素与DNA的相互作用以及最佳条件，这些研究有助于了解蛇床子素在生物体内复杂的相互作用过程，为提高其药效和设计新药提供参考价值。
1 实验部分
1.1 仪器
FLS 920荧光光谱仪（英国Edingburgh公司）；pHS-3B型精密酸度计（上海雷磁仪器）；BT25S电子分析天平（Sartorius公司）。
1.2 试剂
5.0×10-3 mol/L蛇床子素储备液：准确称取1.22 mg蛇床子素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：110822-200407），用乙醇溶解并定容至1 mL，涡旋溶解即得。用时再用乙醇稀释至所需浓度。
50 mmol/L MES缓冲液：称取0.533 g MES，溶于40 mL蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至5.5，最后加蒸馏水定容至50 mL即可。所用试剂均为分析纯，实验用水均为Millipore Milli-Q系统净化的超纯水。
DNA序列：5’-CACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGT-3’；DNA溶液的配制：按说明书加适量缓冲稀释成100 μmol/L的储备液，用时再用缓冲稀释至所需浓度，保存在4℃冰箱中备用。
1.3 荧光光谱的测定
准确移取1.0×10-3 mol/L的蛇床子素溶液10 μL于400 μL比色皿中，加入MES缓冲溶液适量（控制溶液总体积为200 μL），扫描其荧光光谱后，再分别加入一定体积的浓度为100 nmol/L的DNA溶液，混合均匀并静置30 min，于340 nm为激发波长，408 nm为发射波长，激发和发射狭缝都是3 nm条件下，测定荧光强度F值。
2 结果与讨论
2.1 光谱特征
蛇床子素、DNA和蛇床子素-DNA复合物的激发和发射光谱分别如图1和图2所示。由发射光谱图可以看出，DNA的荧光信号很弱，蛇床子素的荧光信号最强，当加入DNA后，体系的荧光信号强度明显减弱，可见DNA对蛇床子素的荧光具有猝灭作用。结果表明蛇床子素与DNA之间发生了较强的相互作用。
.2 酸度与缓冲溶液的影响
考查了缓冲溶液的类型和pH值对荧光信号猝灭程度的影响。分别用Tris-HCl，PBS和MES 3种缓冲进行了试验，结果表明，在MES缓冲溶液中猝灭效果最为显著，并且当pH=5.5时加入DNA前后的△F达到最大值。因此选用pH=5.5的MES缓冲溶液作为本实验的最佳缓冲溶液。
2.3 离子强度与盐效应的影响
通过向体系中加入不同量的NaCl来考查离子强度和盐效应对体系的影响。当NaCl的浓度在<10 mmol/L的情况下，体系的荧光强度没有明显的影响。
2.4 DNA变性实验
将DNA在100℃的沸水中煮20 min后，立即拿出放入冰水中冷却后，再将其加入蛇床子素的荧光体系中，发现此时荧光信号未降低，即变性后的DNA不能猝灭蛇床子素的荧光强度。
2.5 线性范围
将蛇床子素的浓度固定为1.0×10-3 mol/L，取样量为10 μL，改变DNA的浓度，分别测得荧光强度。荧光光谱如图3所示。结果表明：在最佳条件下，体系的荧光强度与DNA的浓度在10～40 nmol/L范围内呈线性关系。线性方程为：y=-798.99x+72 856，R2=0.9942，检测限为1.2 nmol/L。
3 结论
蛇床子素又名甲氧基欧芹酚或欧芹酚甲醚（Osthole），其化学名称为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，是蛇床子中含量最高的一种烃基香豆素类有效化学成分[2]。现代药理实验研究表明蛇床子素具有抗高血脂[3]、抗心律失常[4]、抗衰老[5]、抗肿瘤[6-7]、抗骨质疏松症[8]、抗炎及抗变态反应[9-11]等功效。周俊等[12]研究发现，蛇床子素对肺鳞癌和肺腺癌的瘤体生长有一定的抑制作用。
脱氧核糖核酸（DNA）是人体内一类重要的遗传物质，是抗肿瘤药物作用的重要靶点之一。许多分子能与DNA分子发生相互作用，进而影响DNA的复制，因此研究小分子与DNA的作用，对于从分子水平上了解抗癌药物作用机理以及以DNA为靶点的药物分子设计具有重要意义[13-14]。
从本研究结果可以看出，蛇床子素与DNA之间有着较强的的相互作用，这种结合作用导致了体系荧光强度的猝灭，并且经过优化，发现这种猝灭的效果在pH=5.5的MES缓冲溶液中表现较为显著，同时体系在盐浓度<10 mmol/L的情况下影响不大；在最佳条件下，体系的荧光强度与DNA的浓度在10～40 nmol/L范围内呈线性关系。但是具体是静态猝灭还是动态猝灭，以及这种相互作用的方式是吸附还是嵌入都还有待进一步研究讨论。
[参考文献]
[1] 胡玉婷，张国文.蛇床子素与人血清白蛋白相互作用的光谱学特征[J].南昌大学学报（理科版），2012，36（3）：251-253. [2] 闫俊，宣伟东，卞俊.蛇床子素的研究进展[J].中国药业，2012，21（11）：110-112.
[3] 宋芳，谢涛，鲍君杰，等.蛇床子素对大鼠的降血脂作用[J].苏州大学学报（医学版），2006，26（4）：579-581.
[4] 沈丽霞，金乐群，张丹参，等.蛇床子素的抗实验性心律失常作用[J].张家口医学院学报，2001，18（1）：9-10.
[5] 王书华，安芳，张丹参，等.蛇床子素抗氧化作用的实验研究[J].中成药，2005，27（4）：488-489.
[6] 沈秀，周则卫，刘培勋，等.蛇床子素对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用[J].中华医学实践杂志，2006，5（3）：241-243.
[7] 王可，苑振亭，王金海，等.蛇床子素抑制HaCaT细胞增殖及诱导凋亡的影响[J].中国现代医药杂志，2009，11（2）：53-55.
[8] 王艳，潘永梅.蛇床子素对新生大鼠颅骨成骨细胞中OPG、RAN-KL mRNA表达的影响[J].山西中医学院学报，2008，9（3）：12-14.
[9] 李宁，杨小红.蛇床子有效成分对金黄色葡萄球菌凝固酶活性的影响[J].广东医学，2007，28（6）：876-877.
[10] 连其深，周俐，叶和扬，等.蛇床子素抗炎作用的实验研究[J].赣南医学院学报，1999，19（3）：165-168.
[11] 陈志春，段晓波，刘坤荣.蛇床子素抗变态反应的研究[J].药学学报，1998，23（2）：96-99.
[12] 周俊，程维兴，许永华，等.蛇床子素对肺腺癌、肺鳞癌生长抑制作用的实验研究[J].癌变·畸变·突变，2002，14（4）：231-233.
[13] Kanrigiannis G，Papaioannou D.Structure，biological activity and synthesis of polyamine analogues and conjugates[J].Eur J Org Chem，2000，（10）：1841-1863.
[14] 康敬萬，苏碧泉，李志峰，等.芦丁合钴与DNA相互作用研究[J].化学研究与应用，2006，18（4）：360-364.
（收稿日期：2013-03-19）
[关键词] 蛇床子素；脱氧核糖核酸；相互作用
[中圖分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）07-33-02
近年来，由于天然植物有效成分被广泛应用于生物制品、药物等领域[1]，天然植物的活性成分与DNA的相互作用的研究受到了广泛关注，蛇床子素与DNA结合作用研究还未见到。因此本文采用荧光光谱法，探讨了蛇床子素与DNA的相互作用以及最佳条件，这些研究有助于了解蛇床子素在生物体内复杂的相互作用过程，为提高其药效和设计新药提供参考价值。
1 实验部分
1.1 仪器
FLS 920荧光光谱仪（英国Edingburgh公司）；pHS-3B型精密酸度计（上海雷磁仪器）；BT25S电子分析天平（Sartorius公司）。
1.2 试剂
5.0×10-3 mol/L蛇床子素储备液：准确称取1.22 mg蛇床子素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：110822-200407），用乙醇溶解并定容至1 mL，涡旋溶解即得。用时再用乙醇稀释至所需浓度。
50 mmol/L MES缓冲液：称取0.533 g MES，溶于40 mL蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至5.5，最后加蒸馏水定容至50 mL即可。所用试剂均为分析纯，实验用水均为Millipore Milli-Q系统净化的超纯水。
DNA序列：5’-CACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGT-3’；DNA溶液的配制：按说明书加适量缓冲稀释成100 μmol/L的储备液，用时再用缓冲稀释至所需浓度，保存在4℃冰箱中备用。
1.3 荧光光谱的测定
准确移取1.0×10-3 mol/L的蛇床子素溶液10 μL于400 μL比色皿中，加入MES缓冲溶液适量（控制溶液总体积为200 μL），扫描其荧光光谱后，再分别加入一定体积的浓度为100 nmol/L的DNA溶液，混合均匀并静置30 min，于340 nm为激发波长，408 nm为发射波长，激发和发射狭缝都是3 nm条件下，测定荧光强度F值。
2 结果与讨论
2.1 光谱特征
蛇床子素、DNA和蛇床子素-DNA复合物的激发和发射光谱分别如图1和图2所示。由发射光谱图可以看出，DNA的荧光信号很弱，蛇床子素的荧光信号最强，当加入DNA后，体系的荧光信号强度明显减弱，可见DNA对蛇床子素的荧光具有猝灭作用。结果表明蛇床子素与DNA之间发生了较强的相互作用。
.2 酸度与缓冲溶液的影响
考查了缓冲溶液的类型和pH值对荧光信号猝灭程度的影响。分别用Tris-HCl，PBS和MES 3种缓冲进行了试验，结果表明，在MES缓冲溶液中猝灭效果最为显著，并且当pH=5.5时加入DNA前后的△F达到最大值。因此选用pH=5.5的MES缓冲溶液作为本实验的最佳缓冲溶液。
2.3 离子强度与盐效应的影响
通过向体系中加入不同量的NaCl来考查离子强度和盐效应对体系的影响。当NaCl的浓度在<10 mmol/L的情况下，体系的荧光强度没有明显的影响。
2.4 DNA变性实验
将DNA在100℃的沸水中煮20 min后，立即拿出放入冰水中冷却后，再将其加入蛇床子素的荧光体系中，发现此时荧光信号未降低，即变性后的DNA不能猝灭蛇床子素的荧光强度。
2.5 线性范围
将蛇床子素的浓度固定为1.0×10-3 mol/L，取样量为10 μL，改变DNA的浓度，分别测得荧光强度。荧光光谱如图3所示。结果表明：在最佳条件下，体系的荧光强度与DNA的浓度在10～40 nmol/L范围内呈线性关系。线性方程为：y=-798.99x+72 856，R2=0.9942，检测限为1.2 nmol/L。
3 结论
蛇床子素又名甲氧基欧芹酚或欧芹酚甲醚（Osthole），其化学名称为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，是蛇床子中含量最高的一种烃基香豆素类有效化学成分[2]。现代药理实验研究表明蛇床子素具有抗高血脂[3]、抗心律失常[4]、抗衰老[5]、抗肿瘤[6-7]、抗骨质疏松症[8]、抗炎及抗变态反应[9-11]等功效。周俊等[12]研究发现，蛇床子素对肺鳞癌和肺腺癌的瘤体生长有一定的抑制作用。
脱氧核糖核酸（DNA）是人体内一类重要的遗传物质，是抗肿瘤药物作用的重要靶点之一。许多分子能与DNA分子发生相互作用，进而影响DNA的复制，因此研究小分子与DNA的作用，对于从分子水平上了解抗癌药物作用机理以及以DNA为靶点的药物分子设计具有重要意义[13-14]。
从本研究结果可以看出，蛇床子素与DNA之间有着较强的的相互作用，这种结合作用导致了体系荧光强度的猝灭，并且经过优化，发现这种猝灭的效果在pH=5.5的MES缓冲溶液中表现较为显著，同时体系在盐浓度<10 mmol/L的情况下影响不大；在最佳条件下，体系的荧光强度与DNA的浓度在10～40 nmol/L范围内呈线性关系。但是具体是静态猝灭还是动态猝灭，以及这种相互作用的方式是吸附还是嵌入都还有待进一步研究讨论。
[参考文献]
[1] 胡玉婷，张国文.蛇床子素与人血清白蛋白相互作用的光谱学特征[J].南昌大学学报（理科版），2012，36（3）：251-253. [2] 闫俊，宣伟东，卞俊.蛇床子素的研究进展[J].中国药业，2012，21（11）：110-112.
[3] 宋芳，谢涛，鲍君杰，等.蛇床子素对大鼠的降血脂作用[J].苏州大学学报（医学版），2006，26（4）：579-581.
[4] 沈丽霞，金乐群，张丹参，等.蛇床子素的抗实验性心律失常作用[J].张家口医学院学报，2001，18（1）：9-10.
[5] 王书华，安芳，张丹参，等.蛇床子素抗氧化作用的实验研究[J].中成药，2005，27（4）：488-489.
[6] 沈秀，周则卫，刘培勋，等.蛇床子素对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用[J].中华医学实践杂志，2006，5（3）：241-243.
[7] 王可，苑振亭，王金海，等.蛇床子素抑制HaCaT细胞增殖及诱导凋亡的影响[J].中国现代医药杂志，2009，11（2）：53-55.
[8] 王艳，潘永梅.蛇床子素对新生大鼠颅骨成骨细胞中OPG、RAN-KL mRNA表达的影响[J].山西中医学院学报，2008，9（3）：12-14.
[9] 李宁，杨小红.蛇床子有效成分对金黄色葡萄球菌凝固酶活性的影响[J].广东医学，2007，28（6）：876-877.
[10] 连其深，周俐，叶和扬，等.蛇床子素抗炎作用的实验研究[J].赣南医学院学报，1999，19（3）：165-168.
[11] 陈志春，段晓波，刘坤荣.蛇床子素抗变态反应的研究[J].药学学报，1998，23（2）：96-99.
[12] 周俊，程维兴，许永华，等.蛇床子素对肺腺癌、肺鳞癌生长抑制作用的实验研究[J].癌变·畸变·突变，2002，14（4）：231-233.
[13] Kanrigiannis G，Papaioannou D.Structure，biological activity and synthesis of polyamine analogues and conjugates[J].Eur J Org Chem，2000，（10）：1841-1863.
[14] 康敬萬，苏碧泉，李志峰，等.芦丁合钴与DNA相互作用研究[J].化学研究与应用，2006，18（4）：360-364.
（收稿日期：2013-03-19）