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摘要[目的]构建盐生植物盐芥高效率嫁接体系。[方法]利用拟南芥下胚轴水平切割的方法进行了盐芥的无菌嫁接。[结果]苗龄是影响嫁接成功与否的关键因素，萌发7～10 d的幼苗为最佳嫁接苗，苗龄过小或过大均不利于嫁接，同时不同的蔗糖浓度及铁盐也对嫁接有一定影响。[结论]盐芥嫁接体系的成功构建为进一步研究盐生植物地上与地下互作及长距离信号传递的耐逆分子机理提供了参考。
关键词 嫁接；盐芥；下胚轴
中图分类号 S-03 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）27-0020-03
Abstract [Objective] The aim was to establish an efficient grafting system for halophyte Eutrema salsuginea. [Method] The sterile grafting of Eutrema salsuginea was realized bu using a new method of grafting which used the hypocotyl horizontal cutting method with a two edge razor blade. [Result] The size of the age of seedling was the key factor that affected the success of the graft；the germination 7-10 days of seedlings was the best grafting period， and too small or too large seedlings were not good for grafting. Furthermore， different concentrations of sucrose and molysite also had certain influence on grafting. [Conclusion] This method will be good for the study of between ground and underground interactions and the molecular mechanism of the long distance signal transmission of halophytes.
Key words Grafting；Eutrema salsuginea （Thellungiella salsuginea）；Hypocotyl
微嫁接是一種在试管内将砧木与接穗进行嫁接的技术，是植物组织培养与嫁接技术的结合[1-3]。微嫁接技术已广泛应用于柑橘、苹果、桃、葡萄和龙眼等多种果树的研究与生产中。微嫁接具有其自身特有的优越性[1，4]：周期短、费用低、占地少、成活率高；进行微嫁接后，生长条件可以人为控制，提高了有关科学研究的可信度；不受季节的限制和环境的影响，可以在实验室常年进行；有利于进行嫁接亲和力的研究。
微嫁接中的草本植物的嫁接不像果树、林木等木本植物的嫁接要求砧木和接穗的形成层要对齐相接。
无论草本植物还是木本植物的嫁接，影响嫁接成活的因素主要取决于砧木与接穗的亲和力。此外，砧木与接穗的质量同样也是影响嫁接成活的重要因素，温度、湿度及光照等方面的差异也会影响嫁接的成活率。另外，不同物种不同时期的嫁接成活率也不同，即使是同一物种在不同时期，其嫁接体的成活率也相差很大。
植物的嫁接是研究长距离信号传递、基因转移及地上与地下部分互作分子机理的理想方法之一。关于植物遗传学双子叶植物研究中的模式植物拟南芥的嫁接技术早在20多年以前就有报道[5-6]，拟南芥这种体型微小的植物体的嫁接难度很大，各种方法均能实现，但效率不高，比如下胚轴的嫁接中，最早利用下胚轴切割进行拟南芥嫁接的报道中成功率不超过50%[7]。拟南芥嫁接系统可用于研究物质运输、信号传导、成花诱导、系统抗性、非生物胁迫的应答[5，7-12]及smRNA调控[13-14]、信号长距离应答、基因沉默[15-16]等很多方面。拟南芥合适的嫁接位点是花序轴和下胚轴部位。花序轴部位的嫁接可以采用劈接和平接的方法[5-6]，Turnbull等[7]首次建立了拟南芥下胚轴嫁接系统，采用在培养皿中生长的拟南芥幼苗， 在超净台的体视显微镜下，将幼苗从下胚轴部位（子叶稍靠下部位）切断， 然后进行自体或同种嫁接。而作为同属于十字花科的盐芥，与拟南芥有很多相似性状，其全基因测序也早已完成，以盐芥作为耐盐模式植物来研究植物耐盐机理及分子机制也越来越受到科学家的重视，但有关盐芥嫁接方法的研究鲜见报道。鉴于此，笔者采用微嫁接技术构建了盐生植物盐芥高效率嫁接体系，以期为进一步研究盐生植物地上与地下互作及长距离信号传递的耐逆分子机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
中国山东东营生态型盐芥Eutrema salsuginea（Thellungiella salsuginea）。
1.2 方法
采用下胚轴水平切割法进行植物微嫁接中的自体嫁接和同种嫁接。
1.2.1
砧木和接穗材料的准备。将籽粒饱满的盐芥种子用0.5%NaClO消毒并种在固体培养基（含0.4%Sigma GelzanTM CM Agar、1%蔗糖、0.15 mmol/L Fe2+的1/2MS培养基）上，该过程在无菌超净台上操作。4 ℃层积7 d后置于短日照或长日照光照培养箱内竖直培养萌发备用。种子消毒是直接用05% NaClO消毒6～8 min，然后用无菌水清洗4～6次。
1.2.2 切割及嫁接。将萌发后7～10 d长势一致的无菌苗盐芥用镊子移至新的固体培养基上，用双面刀片将盐芥的下胚轴距上端约小于1/2处水平切割，切开的地上部分为接穗，切下的地下部分作为砧木备用。并在解剖镜下将二者切口在内径/外径为0.3/1.5 mm的无菌塑料管中对接好，每个直径9 cm培养皿中可以嫁接7～14株，嫁接后及时将培养皿封口以保湿。该过程在无菌超净台上操作。用于嫁接的培养基中的蔗糖含量多少也影响着嫁接苗的成活率，根据筛选试验发现培养基的差别不大，而不同浓度的蔗糖对嫁接苗的成活率影响存在较大差异，其中以1%蔗糖更有利于嫁接苗的成活，且其他条件不变的情况下污染大大降低。
1.2.3
嫁接体的培养。将嫁接好的盐芥/盐芥复合体置于短日照光照培养箱中竖直培养10～15 d。
1.2.4
嫁接苗的移栽。将嫁接后培养10～15 d的嫁接复合体在解剖镜下观察嫁接口是否连接好，将嫁接成功的嫁接苗根据试验需要移栽至水培或营养土中继续培养。在该期间嫁接苗接穗下胚轴若有侧根出现，及时剪去。
1.2.5 嫁接條件。
上述嫁接方法中，长日照条件为16 h光照/8 h黑暗，光照条件下的温度为21～23 ℃，黑暗条件下的温度为18～20 ℃，光强为8 000 lx，相对湿度大于70%。而“1.2.3”和“1.2.4”的短日照条件为8 h光照/16 h黑暗，温度、光强及湿度同长日照条件。
2 结果与分析
2.1 不同发育时期的无菌苗对嫁接效率的影响
作为砧木和接穗的盐芥幼苗，其萌发时间的选择会影响嫁接的成活率以及嫁接苗后期的长势。对于砧木苗和接穗苗选择调整为：萌发后7～10 d的盐芥无菌苗，嫁接后嫁接苗的成活率以及后期长势最好（表1）。嫁接成功的嫁接苗如图1所示。
选用萌发7～10 d的略大的盐芥幼苗，其侧根已长出，且细胞分生能力强，能大大提高嫁接成活率及保证嫁接苗后期生长旺盛。由于盐芥在萌发初期生长缓慢，在营养土中萌发后的前21 d为其生长缓慢期，21 d后会迅速生长，在培养皿中其生长缓慢期有所缩短，但仍存在，在萌发7 d后会迅速生长，所以用较小苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易导致嫁接后的嫁接苗生长缓慢，侧根较多且长势较差，选用萌发7～10 d的幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，还能进一步保证嫁接苗后期生长的旺盛强壮。
2.2 蔗糖浓度对嫁接苗的影响
对固体培养基中蔗糖的浓度进行调整，并观察不同浓度蔗糖对嫁接苗成活率的影响。
由表2可知，蔗糖的浓度也影响着嫁接苗的成活率，不同浓度的蔗糖对嫁接苗的成活率影响存在较大差异，其中1.0%蔗糖有利于嫁接苗的成活且污染最小。
2.3 Fe2+浓度对嫁接苗的影响
进一步对固体培养基中Fe2+浓度进行调整，观察嫁接后嫁接苗的成活率。由表3可知，用于嫁接的Fe2+的浓度也影响着嫁接苗的成活率，根据筛选发现不同浓度的Fe2+对嫁接苗的成活率影响存在差异，其中0.15 mmol/L铁盐更有利于嫁接苗的正常生长。
3 结论与讨论
该研究采取的方法为草本植物嫁接中的微嫁接技术，即利用拟南芥下胚轴水平切割的方法进行超净台无菌嫁接。通过比较发现不同时期的盐芥苗影响着嫁接的成活率。这与文献报道一致，Navarro等[17]发现用作砧木或接穗的试管苗的苗龄对微嫁接的成活起非常关键的作用。其他科研人员也证明了用作砧木或接穗的苗龄影响嫁接成活率[18-21]。该研究发现，用萌发后7～10 d的无菌盐芥苗做接穗和砧木其嫁接成活率最高，较大与较小苗龄的无菌苗嫁接成活率均较低。该研究同样发现完全借鉴利用拟南芥嫁接的方法，用刚刚萌发3～5 d的盐芥嫁接很难成活，即使接合部位能够暂时愈合，后期生长缓慢，大部分最终不易成活，效率很低。而用萌发7 d后的幼苗嫁接成活率能达到96%以上，而且很少出现侧生根，嫁接不成功的为4%，主要原因是嫁接时虽然对接成功，但嫁接完封皿后，接穗的叶子由萎蔫到恢复自然状态时导致接穗与砧木错位，只要不错位，能达到100%的成功率。
在柑橘的微嫁接过程中[17]发现培养基中蔗糖浓度对微嫁接的成活起非常关键的作用，培养基中的蔗糖浓度为7.5%时，微嫁接成活率最高为 90%；而蔗糖浓度为 2.5%时，成活率仅为55%。该研究发现蔗糖含量的多少也会影响嫁接的效率，当蔗糖浓度为1.0%时效果较好，因为是无菌嫁接，而且操作过程时间较长，易污染，蔗糖浓度太高，污染程度增大，反而降低了嫁接苗的成活率。
该研究还发现普通的1/2MS培养基中盐芥幼苗的叶子发黄，当适当增加Fe2+的浓度后，幼苗叶子会变正常，并且0.15 mmol/L铁盐更有利于盐芥幼苗及嫁接苗的正常生长。
综上所述，在几个影响因素中，起决定作用的是盐芥无菌苗的苗龄，若选择太小的幼苗做接穗和砧木，因为盐芥自身发育的特点，该时期植株生长缓慢，导致嫁接苗生长缓慢，侧根多而不易成活，即使成活，后期长势也弱。而太大的苗子不易切割，分生组织没有幼苗活跃，嫁接效率下降。萌发后7～10 d的无菌苗是最佳嫁接苗，易切割，易成活，嫁接效率最高。
盐芥作为一种极度耐盐、干旱、低温、高热等非生物胁迫的盐生植物的模式植物[22-23]，在过去的十多年间被广泛应用于非生物胁迫的生理生化及分子生物学方面的研究，其嫁接体系的成功构建将为研究植物体中水平基因转移、信号转导、非生物胁迫等生理生化特别是植物耐盐分子机理方面提供参考。
参考文献
[1] JONARD R，HUGARD J，MACHEIX J J，et al.In vitro micrografting and its applications to fruit science[J].Sci Hortic，1983，20（2）：l47-159. [2] ESTRADALUNA A A，LEZPERALTA C，CDENASSORIANO E.In vitro micrografting and the histology of graft union formation of selected species of prickly pear cactus（Opuntia spp.）[J].Sci Hortic，2002，92（3/4）：317-327.
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关键词 嫁接；盐芥；下胚轴
中图分类号 S-03 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）27-0020-03
Abstract [Objective] The aim was to establish an efficient grafting system for halophyte Eutrema salsuginea. [Method] The sterile grafting of Eutrema salsuginea was realized bu using a new method of grafting which used the hypocotyl horizontal cutting method with a two edge razor blade. [Result] The size of the age of seedling was the key factor that affected the success of the graft；the germination 7-10 days of seedlings was the best grafting period， and too small or too large seedlings were not good for grafting. Furthermore， different concentrations of sucrose and molysite also had certain influence on grafting. [Conclusion] This method will be good for the study of between ground and underground interactions and the molecular mechanism of the long distance signal transmission of halophytes.
Key words Grafting；Eutrema salsuginea （Thellungiella salsuginea）；Hypocotyl
微嫁接是一種在试管内将砧木与接穗进行嫁接的技术，是植物组织培养与嫁接技术的结合[1-3]。微嫁接技术已广泛应用于柑橘、苹果、桃、葡萄和龙眼等多种果树的研究与生产中。微嫁接具有其自身特有的优越性[1，4]：周期短、费用低、占地少、成活率高；进行微嫁接后，生长条件可以人为控制，提高了有关科学研究的可信度；不受季节的限制和环境的影响，可以在实验室常年进行；有利于进行嫁接亲和力的研究。
微嫁接中的草本植物的嫁接不像果树、林木等木本植物的嫁接要求砧木和接穗的形成层要对齐相接。
无论草本植物还是木本植物的嫁接，影响嫁接成活的因素主要取决于砧木与接穗的亲和力。此外，砧木与接穗的质量同样也是影响嫁接成活的重要因素，温度、湿度及光照等方面的差异也会影响嫁接的成活率。另外，不同物种不同时期的嫁接成活率也不同，即使是同一物种在不同时期，其嫁接体的成活率也相差很大。
植物的嫁接是研究长距离信号传递、基因转移及地上与地下部分互作分子机理的理想方法之一。关于植物遗传学双子叶植物研究中的模式植物拟南芥的嫁接技术早在20多年以前就有报道[5-6]，拟南芥这种体型微小的植物体的嫁接难度很大，各种方法均能实现，但效率不高，比如下胚轴的嫁接中，最早利用下胚轴切割进行拟南芥嫁接的报道中成功率不超过50%[7]。拟南芥嫁接系统可用于研究物质运输、信号传导、成花诱导、系统抗性、非生物胁迫的应答[5，7-12]及smRNA调控[13-14]、信号长距离应答、基因沉默[15-16]等很多方面。拟南芥合适的嫁接位点是花序轴和下胚轴部位。花序轴部位的嫁接可以采用劈接和平接的方法[5-6]，Turnbull等[7]首次建立了拟南芥下胚轴嫁接系统，采用在培养皿中生长的拟南芥幼苗， 在超净台的体视显微镜下，将幼苗从下胚轴部位（子叶稍靠下部位）切断， 然后进行自体或同种嫁接。而作为同属于十字花科的盐芥，与拟南芥有很多相似性状，其全基因测序也早已完成，以盐芥作为耐盐模式植物来研究植物耐盐机理及分子机制也越来越受到科学家的重视，但有关盐芥嫁接方法的研究鲜见报道。鉴于此，笔者采用微嫁接技术构建了盐生植物盐芥高效率嫁接体系，以期为进一步研究盐生植物地上与地下互作及长距离信号传递的耐逆分子机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
中国山东东营生态型盐芥Eutrema salsuginea（Thellungiella salsuginea）。
1.2 方法
采用下胚轴水平切割法进行植物微嫁接中的自体嫁接和同种嫁接。
1.2.1
砧木和接穗材料的准备。将籽粒饱满的盐芥种子用0.5%NaClO消毒并种在固体培养基（含0.4%Sigma GelzanTM CM Agar、1%蔗糖、0.15 mmol/L Fe2+的1/2MS培养基）上，该过程在无菌超净台上操作。4 ℃层积7 d后置于短日照或长日照光照培养箱内竖直培养萌发备用。种子消毒是直接用05% NaClO消毒6～8 min，然后用无菌水清洗4～6次。
1.2.2 切割及嫁接。将萌发后7～10 d长势一致的无菌苗盐芥用镊子移至新的固体培养基上，用双面刀片将盐芥的下胚轴距上端约小于1/2处水平切割，切开的地上部分为接穗，切下的地下部分作为砧木备用。并在解剖镜下将二者切口在内径/外径为0.3/1.5 mm的无菌塑料管中对接好，每个直径9 cm培养皿中可以嫁接7～14株，嫁接后及时将培养皿封口以保湿。该过程在无菌超净台上操作。用于嫁接的培养基中的蔗糖含量多少也影响着嫁接苗的成活率，根据筛选试验发现培养基的差别不大，而不同浓度的蔗糖对嫁接苗的成活率影响存在较大差异，其中以1%蔗糖更有利于嫁接苗的成活，且其他条件不变的情况下污染大大降低。
1.2.3
嫁接体的培养。将嫁接好的盐芥/盐芥复合体置于短日照光照培养箱中竖直培养10～15 d。
1.2.4
嫁接苗的移栽。将嫁接后培养10～15 d的嫁接复合体在解剖镜下观察嫁接口是否连接好，将嫁接成功的嫁接苗根据试验需要移栽至水培或营养土中继续培养。在该期间嫁接苗接穗下胚轴若有侧根出现，及时剪去。
1.2.5 嫁接條件。
上述嫁接方法中，长日照条件为16 h光照/8 h黑暗，光照条件下的温度为21～23 ℃，黑暗条件下的温度为18～20 ℃，光强为8 000 lx，相对湿度大于70%。而“1.2.3”和“1.2.4”的短日照条件为8 h光照/16 h黑暗，温度、光强及湿度同长日照条件。
2 结果与分析
2.1 不同发育时期的无菌苗对嫁接效率的影响
作为砧木和接穗的盐芥幼苗，其萌发时间的选择会影响嫁接的成活率以及嫁接苗后期的长势。对于砧木苗和接穗苗选择调整为：萌发后7～10 d的盐芥无菌苗，嫁接后嫁接苗的成活率以及后期长势最好（表1）。嫁接成功的嫁接苗如图1所示。
选用萌发7～10 d的略大的盐芥幼苗，其侧根已长出，且细胞分生能力强，能大大提高嫁接成活率及保证嫁接苗后期生长旺盛。由于盐芥在萌发初期生长缓慢，在营养土中萌发后的前21 d为其生长缓慢期，21 d后会迅速生长，在培养皿中其生长缓慢期有所缩短，但仍存在，在萌发7 d后会迅速生长，所以用较小苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易导致嫁接后的嫁接苗生长缓慢，侧根较多且长势较差，选用萌发7～10 d的幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，还能进一步保证嫁接苗后期生长的旺盛强壮。
2.2 蔗糖浓度对嫁接苗的影响
对固体培养基中蔗糖的浓度进行调整，并观察不同浓度蔗糖对嫁接苗成活率的影响。
由表2可知，蔗糖的浓度也影响着嫁接苗的成活率，不同浓度的蔗糖对嫁接苗的成活率影响存在较大差异，其中1.0%蔗糖有利于嫁接苗的成活且污染最小。
2.3 Fe2+浓度对嫁接苗的影响
进一步对固体培养基中Fe2+浓度进行调整，观察嫁接后嫁接苗的成活率。由表3可知，用于嫁接的Fe2+的浓度也影响着嫁接苗的成活率，根据筛选发现不同浓度的Fe2+对嫁接苗的成活率影响存在差异，其中0.15 mmol/L铁盐更有利于嫁接苗的正常生长。
3 结论与讨论
该研究采取的方法为草本植物嫁接中的微嫁接技术，即利用拟南芥下胚轴水平切割的方法进行超净台无菌嫁接。通过比较发现不同时期的盐芥苗影响着嫁接的成活率。这与文献报道一致，Navarro等[17]发现用作砧木或接穗的试管苗的苗龄对微嫁接的成活起非常关键的作用。其他科研人员也证明了用作砧木或接穗的苗龄影响嫁接成活率[18-21]。该研究发现，用萌发后7～10 d的无菌盐芥苗做接穗和砧木其嫁接成活率最高，较大与较小苗龄的无菌苗嫁接成活率均较低。该研究同样发现完全借鉴利用拟南芥嫁接的方法，用刚刚萌发3～5 d的盐芥嫁接很难成活，即使接合部位能够暂时愈合，后期生长缓慢，大部分最终不易成活，效率很低。而用萌发7 d后的幼苗嫁接成活率能达到96%以上，而且很少出现侧生根，嫁接不成功的为4%，主要原因是嫁接时虽然对接成功，但嫁接完封皿后，接穗的叶子由萎蔫到恢复自然状态时导致接穗与砧木错位，只要不错位，能达到100%的成功率。
在柑橘的微嫁接过程中[17]发现培养基中蔗糖浓度对微嫁接的成活起非常关键的作用，培养基中的蔗糖浓度为7.5%时，微嫁接成活率最高为 90%；而蔗糖浓度为 2.5%时，成活率仅为55%。该研究发现蔗糖含量的多少也会影响嫁接的效率，当蔗糖浓度为1.0%时效果较好，因为是无菌嫁接，而且操作过程时间较长，易污染，蔗糖浓度太高，污染程度增大，反而降低了嫁接苗的成活率。
该研究还发现普通的1/2MS培养基中盐芥幼苗的叶子发黄，当适当增加Fe2+的浓度后，幼苗叶子会变正常，并且0.15 mmol/L铁盐更有利于盐芥幼苗及嫁接苗的正常生长。
综上所述，在几个影响因素中，起决定作用的是盐芥无菌苗的苗龄，若选择太小的幼苗做接穗和砧木，因为盐芥自身发育的特点，该时期植株生长缓慢，导致嫁接苗生长缓慢，侧根多而不易成活，即使成活，后期长势也弱。而太大的苗子不易切割，分生组织没有幼苗活跃，嫁接效率下降。萌发后7～10 d的无菌苗是最佳嫁接苗，易切割，易成活，嫁接效率最高。
盐芥作为一种极度耐盐、干旱、低温、高热等非生物胁迫的盐生植物的模式植物[22-23]，在过去的十多年间被广泛应用于非生物胁迫的生理生化及分子生物学方面的研究，其嫁接体系的成功构建将为研究植物体中水平基因转移、信号转导、非生物胁迫等生理生化特别是植物耐盐分子机理方面提供参考。
参考文献
[1] JONARD R，HUGARD J，MACHEIX J J，et al.In vitro micrografting and its applications to fruit science[J].Sci Hortic，1983，20（2）：l47-159. [2] ESTRADALUNA A A，LEZPERALTA C，CDENASSORIANO E.In vitro micrografting and the histology of graft union formation of selected species of prickly pear cactus（Opuntia spp.）[J].Sci Hortic，2002，92（3/4）：317-327.
[3] MURASHIGE T，BITTERS W P，RANGAN T S，et al.A technique of shoot apex grafting and its utilization towards recovering virusfree citrus clone[J].J Hortic Sci，1972，7：118-119.
[4] OLLAT N，POIZAT C，LIMA D S A，et al.Quantitative rootstockscion relationships in grapevine：Investigations by the analysis of reciprocal micrograftings.Book of abstracts of 6th international symposium on grape vine[J].Physiology and biotechnology，2000，11（15）：70-71.
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