【摘 要】
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精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase,EC 3.5.3.6,ADI)因其可作为精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞的靶向治疗药物而受到广泛关注.目前,支原体来源的重组ADI处于肝癌和黑素瘤的三期临
【机 构】
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江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室;
【基金项目】
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国家自然科学基金(No.30900030);教育部新世纪优秀人才支持计划(No.NCET-11-0658);国家重点基础研究发展计划(973计划,No.2011CB710800);111引智计划(No.111-2-06);江苏高校优势学科建设工程资助项目~~
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精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase,EC 3.5.3.6,ADI)因其可作为精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞的靶向治疗药物而受到广泛关注.目前,支原体来源的重组ADI处于肝癌和黑素瘤的三期临床研究阶段.作为药用酶,当前报道的ADI在体内生理条件下普遍存在酶活低、半衰期短、底物亲和性弱等局限性.本研究结合随机突变及基于理性设计的定点突变两种方法,对研究室前期自主筛选得到的变形假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida来源的ADI经一轮定向进化后所获优势突变株M314(A128T/H404R/I410L)进行分子改造.通过对随机突变法获得的1480个突变株进行96孔板高通量筛选,得到优良突变株M173(A128T/H404R/I410L/K272R);同时,基于同源序列比对及ADI蛋白三维结构同源建模,采用PyMOL软件理性预测和分析其活性中心及附近保守区域氨基酸位点对蛋白功能的影响,选择了6个位点D78E、L223I、P230I、S245D、A275N、R400M分别在M314的基础上进行定点突变,最终获得优势突变株M04(A128T/H404R/I410L/S245D).通过对突变株的酶学性质以及动力学参数分析发现:生理pH值下,突变株M173的酶比活(12.32 U/mg)在M314(9.02 U/mg)的基础上提升36.59%,Kcat/Km提高52.36%;而突变株M04的最适pH由6.5升高至7.0,更接近体内生理pH,其比酶活(14.66 U/mg)较M314提升62.53%,Kcat/Km提高了37.12%.综上结果,本研究结合两种分子改造方法成功地对该ADI在生理pH条件下的酶活和酶学性质进行了改良,并为蛋白质的分子改造策略提供了理论基础和实验依据.
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