研究目的:人源化小鼠是指带有功能性的人类基因、细胞或组织的小鼠模型,常被用于活体研究人生理、病理学问题。具有人造血免疫系统组成的人源化小鼠模型是其中重要的一类。利用转基因或同源重组的方法,将人类基因“放置”在小鼠中能够大大提高多种人造血免疫系统的组成、增强人免疫系统功能,提高其模拟人类疾病的有效性。经过三十年的研究和发展,造血免疫系统人源化小鼠模型已经日趋完善,已在艾滋病、癌症、传染病、血液病研究等许多领域有了广泛的应用。然而,小鼠自身的天然免疫系统对人红细胞的强烈排斥作用阻碍了人源化小鼠模型中人红细胞的有效重建,是此模型的主要短板之一。因此,深入研究小鼠天然免疫系统对人红细胞排斥的机制,并构建具有高水平人红细胞发育的新型人源化小鼠模型对研究人红细胞发育及相关疾病具有重要意义。为此,我博士阶段的工作,以免疫缺陷小鼠为研究对象,通过体内外实验观察人红细胞排斥过程,进一步阐释免疫缺陷小鼠排斥人红细胞的具体机制,并且应该用机制相关试剂构建能够稳定表达人红细胞的人源化小鼠模型。研究方法:(1)吞噬细胞吞噬实验:在体外将小鼠吞噬细胞与人红细胞共培养,利用活细胞工作站(Delta Vision Elite Imaging System)观察吞噬现象。(2)髓系吞噬细胞体外粘附实验:利用荧光显微镜(fluorescence microscope)观察红细胞(red blood cell,RBC)和免疫缺陷小鼠髓系吞噬细胞(myeloid phagocyte)在不同介质环境中的粘附情况。红细胞包括小鼠红细胞和人红细胞,小鼠髓系吞噬细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞,介质包括1640培养基、新鲜人血清、新鲜小鼠血清、热休克小鼠血清(56℃水浴30min)、抗体中和后的小鼠血清、蛇毒血清因子(cobra venom factor,CVF)体内外处理后的小鼠血清、加入小鼠补体的1640培养基,并应用Image-Pro plus软件分析粘附红细胞的髓系细胞百分比(adherence ratio)。(3)人红细胞转输实验:利用流式细胞分析法(flow cytometry,FCM)测定clodronate、蛇毒血清因子(CVF)、clodronate联合CVF处理后免疫缺陷小鼠与PBS对照组免疫缺陷小鼠转输入人红细胞后红细胞的清除效率。(4)造血免疫系统人源化小鼠模型:将人胚胎肝脏细胞尾静脉注入免疫缺陷小鼠构建人干细胞分化模型,利用流式细胞分析法(flow cytometry,FCM)测定CVF和clodronate处理后小鼠模型中不同时间点人造血干细胞分化情况,包括髓系细胞和红细胞重建比例。(5)人红细胞形态学实验:利用活细胞工作站(Delta Vision Elite Imaging System)观察不同微环境中人红细胞形态,包括PBS、1640培养基、新鲜人血清、新鲜小鼠血清及加入人血清的小鼠血清。研究结果:(1)NOD/SCID小鼠吞噬细胞在体外环境中会吞噬人红细胞。(2)免疫缺陷小鼠的血清而非人的血清,能够促进小鼠髓系吞噬细胞对人红细胞的粘附,髓系吞噬细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞及内皮细胞,小鼠补体对人红细胞的调理作用是粘附现象出现的关键因素。(3)单独应用蛇毒血清因子(CVF)消耗小鼠补体不能提高转输入免疫缺陷小鼠中的人红细胞生存时间,但能够延长人红细胞在巨噬细胞清除的免疫缺陷小鼠中的生存时间。(4)蛇毒血清因子(CVF)能够促进已经去除巨噬细胞的人造血干细胞移植免疫缺陷小鼠中人红细胞的重建。(5)人红细胞在免疫缺陷小鼠血清中呈现异形(棘状),并发生凋亡,加入人血清后形态明显恢复,并抑制粘附现象的产生。研究结论:我们的研究为补体在免疫缺陷小鼠排斥人红细胞的粘附介导作用提供了直接证据,并一定程度提高了人红细胞在巨噬细胞清除后的人造血干细胞移植免疫缺陷小鼠中的分化情况,为后续制备更优人源化小鼠模型中人红细胞重建提供新的方向。