【摘 要】
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目的:构建雌激素受体α(ERα) T224A和S559A磷酸化位点突变体载体,在HEK293T细胞中检测其表达及突变体生物活性的改变.方法:以pcDNA3-Flag-ERα为模板,通过重组PCR技术扩增目
【机 构】
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广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科,军事医学科学院生物工程研究所,安徽大学健康科学院,吉林大学分子酶学工程实验室,济南军区总医院实验检验科
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目的:构建雌激素受体α(ERα) T224A和S559A磷酸化位点突变体载体,在HEK293T细胞中检测其表达及突变体生物活性的改变.方法:以pcDNA3-Flag-ERα为模板,通过重组PCR技术扩增目的基因片段并突变碱基,插入pcDNA3-Flag载体;将构建的质粒转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western印迹检测融合蛋白的表达,采用萤光素酶报告基因方法检测ERα突变体的活性改变.结果:T224A和S559A磷酸化位点突变体在HEK293T细胞中得到表达,相对分子质量为66×103.在无雌激素(E2)时,野生型ERα及T224A和S559A突变体的转录活性分别为空载体的1.94、149和1.84倍;在雌激素存在时,野生型ERα活性增强了1.57倍,T224A和S559A突变体活性分别增强了0.54和0.61倍.结论:224位Thr磷酸化修饰对ERα的活性起重要作用,且2个磷酸化位点突变体受雌激素调控减弱.
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