论文部分内容阅读
【摘 要】 乳牙牙髓干细胞是来源于脱落的乳牙牙髓间充质干细胞，具有较强的增殖能力，自我更新能力和多向分化潜能，电子显微镜技术在细胞学方面的应用与发展，为我们更好地了解与研究乳牙牙髓干细胞提供了强有力地技术支持。本文综述了生物电镜技术在乳牙牙髓干细胞成骨向、成软骨向、神经向、脂肪向和成牙本质向等分化研究方面的应用。
【关键词】 生物电镜技术 乳牙牙髓干细胞 成骨细胞 神经细胞 脂肪细胞 成牙本质细胞 倒置显微镜
【中图分类号】 R780.2 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2014）03-0269-01
2003年，美国医学博士Miura等[1]首次从脱落的乳牙牙髓组织中提取出了具有高度增殖能力和多向分化潜能的细胞，将其命名为乳牙牙髓干细胞（Stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）。倒置显微镜下可见明显的集落形成，大多数细胞呈典型的成纤维细胞样长梭形，细胞体积较小，核仁较大。这类细胞具有高度的增殖能力，一定的多分化潜能和自我更新能力等生物学特性，可以向成牙本质细胞、成骨细胞、脂肪、神经细胞等方面分化。自本世纪三十年代末电子显微镜诞生以来，电子显微镜技术就与生物医学研究结下了不解之缘，由于电子显微镜学的渗透，细胞生物学等生命科学得到了突飞猛进的发展[2]。当今的分子生物学研究都是在离心管和吸管中进行的，然而生物学现象都发生在细胞和有生命的系统内，生物电镜技术可以说是细胞生物学的核心技术。
1 SHED向成牙本质细胞方向分化
许诺等[3]将体外扩增的SHED植入免疫耐受小鼠皮下，得到类牙本质的结构，对其进行免疫组化检测，发现其抗牙本质特异性蛋白牙本质涎磷蛋白阳性，电镜下观察到，细胞叠加生长，透光性变差，有杂质贴于细胞表面，换液不能去除，15d左右，部分细胞聚集成散在片状，分布不均匀。28d时结节较多，行茜红染色后成呈阳性，提示矿化细胞有钙盐沉积。此实验证明了SHED具有干细胞重要属性，在体外分化为成牙本质细胞。国外有专家实验发现骨髓干细胞的碱性磷酸酶水平高于乳牙牙髓干细胞的碱性磷酸酶水平，来源于SHED的细胞表现出低水平持续增长的碱性磷酸酶活性却不分化，提示SHED的内在分化趋势可能朝向成牙本质细胞。
2 SHED的成骨能力
路娟英等[4]用RT-PCR法检测干细胞因子作用于乳牙牙髓干细胞后，细胞内骨钙素，骨涎蛋白的改变，从而探讨骨钙素与骨涎蛋白在牙齿再生中的作用。SHED培养一段时间，在倒置相差显微镜下显示以单细胞方式生长，表现为多形性特点，大多数为长梭形或多角形，亦有细胞呈方形或多角形，胞体丰满，胞质均匀，随着干细胞因子浓度的增加，细胞内骨钙素与骨涎蛋白含量也相应增加。
陆家瑜等[5]通过有限稀释法获得乳牙牙髓干细胞，并诱导其形成成骨细胞，表现出与典型成骨细胞相似的形态特征与生物学特征。电镜下显示：原代细胞大多呈长梭形，为呈纤维样细胞，体积较小，少数迅速增殖，呈巢式或集落样生长，细胞间排列紧密，边界不清，约2周达百分之九十汇合。经过诱导3-4天后，细胞由长梭形变为立方形，进而转变为多角形，体积增大，带有数个突起，随着培养时间的增长，有结节状细胞出现，继续培养，有细胞体变大，胞质稀薄，折光性减低等退行性变。揭示了诱导情况下细胞的成骨方向转化。
申元源等[6]将CD34和CD117的表达关联到一起来分选出神经嵴来源的间叶干细胞中的某个细胞群，选用三种标记物：Runx2、骨钙素和骨唾液糖蛋白作为向成骨细胞分化的指标，并运用流式细胞仪分选SHED，经过流式细胞仪分选后，在荧光倒置相差显微镜下观察到：分选后与分选前细胞形态无太大差别，都呈长梭形，集落状生长，细胞间排列紧密，细胞爬片后行HE染色观察，发现选后的两组均有成骨细胞标记物表达。体外形成钙盐沉积和钙化结节。
3 SHED向软骨方向分化
许诺等[3]将SHED与磷酸三钙复合培养后植入裸鼠体内可形成典型的软骨化的骨结构，说明移植材料在没有任何其他诱因的前提下，可在裸鼠内自主发生软骨成骨。SHED原代培养，观察细胞形态倒置显微镜下呈：原代培养三天后贴壁细胞生长，形态呈多形性，随着生长传代，细胞出现梭形成纤维样细胞，大小趋于一致。HE染色观察到大部分细胞呈梭形，体积小，轮廓清晰，细胞核为圆形或卵圆形，体积较大。进行免疫细胞化学染色检测细胞表面抗原，倒置显微镜下STRO-1化学染色阳性表达。提示作为骨组织中软骨修复或软骨化骨修复的种子细胞的可行性。多数实验是通过检测一些特异性标记物来观察SHED体外分化的能力。
4 SHED神经方向分化
王劲松等[7]使用两步诱导法培养SHED，首先将第三代SHED加入神经干特殊的培养基和细胞因子中进行神经球诱导培养，发现其能够形成神经细胞样球体，通过免疫荧光等方法在神经球中观察到神经营养因子的表达，将神经球冰冻切片，免疫荧光染色，倒置显微镜下见神经干中培养的细胞开始聚集，呈现肉眼可见度的球状聚集物，悬浮生长并逐渐变大。免疫荧光鉴定，发现神经营养因子（GDNF）表达呈阳性。证明SHED具有表达和分泌神经营养因子（GDNF）的能力。
5 SHED脂肪方向分化
SHED具有多向分化能力及極高的可塑性，不仅能分化为来源组织的成熟细胞，还能横向分化成不同胚层起源组织的细胞，并出现脂肪细胞特异性标记物过氧化物酶体增殖物激活受体γ2基因的表达。许诺等[8]将分离的SHED培养至第二代时在培养液中加入成脂诱导液（IBMX、Dex、胰岛素、吲哚美辛、庆大霉素），待细胞内成脂滴时终止培养，油红-O染色。倒置显微镜下观察到个别细胞包浆内出现圆形或椭圆形高强度折射点，20天左右可见串珠样透明高亮度点增多，并有部分融合，油红-O染色阳性，提示部分细胞中有脂滴形成。
6 应用展望
人类有二十颗乳牙，因其可以自然脱落方便易得，且无创伤，来源于自体，无免疫排斥反应，具有较高的安全性，SHED已成为临床医学研究的重点。由于其高度增殖能力及多向分化能力，SHED 在治疗骨和牙组织再生修复、神经系统疾病及肌肉萎缩、免疫系统疾病、皮肤外伤、肝脏疾病等方面有广阔的应用前景。作为细胞学研究必不可少的伙伴—生物电镜更成为继续学习与研究的重要方面，掌握好生物电镜技术，可以为我们研究乳牙牙髓干细胞起到重大的推动作用。
参考文献
[1]Miura M， Gronthos S， Zhao M， et al. SHED： stem cells from human exfoliated deciduous teeth[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2003， 100（10）： 5807-5812.
[2]张仲凯， 方琦， 丁铭， 等. 生物电镜技术的应用实践[J]. 云南大学学报 （自然科学版）， 1999， 21： 5-7.
[3]许诺， 陈柯， 申元源. 人乳牙牙髓干细胞的体外培养和鉴定[J]. 南方医科大学学报， 2009， 29（3）： 479-482.
[4]路娟英， 高杰， 麻丹丹， 等. 干细胞因子促进人乳牙牙髓干细胞增殖与向成骨方向分化[J]. 南方医科大学学报， 2011， 31（3）： 531-534.
[5] 陆家瑜， 华丽， 周文锐， 等. 乳牙牙髓干细胞体外诱导成骨细胞的实验研究[J]. 上海口腔医学， 2008， 17（4）： 0-0.
[6]申元源， 陈柯， 许诺. 人乳牙牙髓干细胞体外成骨特性的实验研究[J]. 南方医科大学学报， 2010 （1）： 96-99.
[7]王劲松， 汪璇， 王松灵. 人乳牙牙髓干细胞体外表达和分泌胶质细胞源性神经营养因子的研究[J]. 北京口腔医学， 2011， 19（5）： 245-248
【关键词】 生物电镜技术 乳牙牙髓干细胞 成骨细胞 神经细胞 脂肪细胞 成牙本质细胞 倒置显微镜
【中图分类号】 R780.2 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2014）03-0269-01
2003年，美国医学博士Miura等[1]首次从脱落的乳牙牙髓组织中提取出了具有高度增殖能力和多向分化潜能的细胞，将其命名为乳牙牙髓干细胞（Stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）。倒置显微镜下可见明显的集落形成，大多数细胞呈典型的成纤维细胞样长梭形，细胞体积较小，核仁较大。这类细胞具有高度的增殖能力，一定的多分化潜能和自我更新能力等生物学特性，可以向成牙本质细胞、成骨细胞、脂肪、神经细胞等方面分化。自本世纪三十年代末电子显微镜诞生以来，电子显微镜技术就与生物医学研究结下了不解之缘，由于电子显微镜学的渗透，细胞生物学等生命科学得到了突飞猛进的发展[2]。当今的分子生物学研究都是在离心管和吸管中进行的，然而生物学现象都发生在细胞和有生命的系统内，生物电镜技术可以说是细胞生物学的核心技术。
1 SHED向成牙本质细胞方向分化
许诺等[3]将体外扩增的SHED植入免疫耐受小鼠皮下，得到类牙本质的结构，对其进行免疫组化检测，发现其抗牙本质特异性蛋白牙本质涎磷蛋白阳性，电镜下观察到，细胞叠加生长，透光性变差，有杂质贴于细胞表面，换液不能去除，15d左右，部分细胞聚集成散在片状，分布不均匀。28d时结节较多，行茜红染色后成呈阳性，提示矿化细胞有钙盐沉积。此实验证明了SHED具有干细胞重要属性，在体外分化为成牙本质细胞。国外有专家实验发现骨髓干细胞的碱性磷酸酶水平高于乳牙牙髓干细胞的碱性磷酸酶水平，来源于SHED的细胞表现出低水平持续增长的碱性磷酸酶活性却不分化，提示SHED的内在分化趋势可能朝向成牙本质细胞。
2 SHED的成骨能力
路娟英等[4]用RT-PCR法检测干细胞因子作用于乳牙牙髓干细胞后，细胞内骨钙素，骨涎蛋白的改变，从而探讨骨钙素与骨涎蛋白在牙齿再生中的作用。SHED培养一段时间，在倒置相差显微镜下显示以单细胞方式生长，表现为多形性特点，大多数为长梭形或多角形，亦有细胞呈方形或多角形，胞体丰满，胞质均匀，随着干细胞因子浓度的增加，细胞内骨钙素与骨涎蛋白含量也相应增加。
陆家瑜等[5]通过有限稀释法获得乳牙牙髓干细胞，并诱导其形成成骨细胞，表现出与典型成骨细胞相似的形态特征与生物学特征。电镜下显示：原代细胞大多呈长梭形，为呈纤维样细胞，体积较小，少数迅速增殖，呈巢式或集落样生长，细胞间排列紧密，边界不清，约2周达百分之九十汇合。经过诱导3-4天后，细胞由长梭形变为立方形，进而转变为多角形，体积增大，带有数个突起，随着培养时间的增长，有结节状细胞出现，继续培养，有细胞体变大，胞质稀薄，折光性减低等退行性变。揭示了诱导情况下细胞的成骨方向转化。
申元源等[6]将CD34和CD117的表达关联到一起来分选出神经嵴来源的间叶干细胞中的某个细胞群，选用三种标记物：Runx2、骨钙素和骨唾液糖蛋白作为向成骨细胞分化的指标，并运用流式细胞仪分选SHED，经过流式细胞仪分选后，在荧光倒置相差显微镜下观察到：分选后与分选前细胞形态无太大差别，都呈长梭形，集落状生长，细胞间排列紧密，细胞爬片后行HE染色观察，发现选后的两组均有成骨细胞标记物表达。体外形成钙盐沉积和钙化结节。
3 SHED向软骨方向分化
许诺等[3]将SHED与磷酸三钙复合培养后植入裸鼠体内可形成典型的软骨化的骨结构，说明移植材料在没有任何其他诱因的前提下，可在裸鼠内自主发生软骨成骨。SHED原代培养，观察细胞形态倒置显微镜下呈：原代培养三天后贴壁细胞生长，形态呈多形性，随着生长传代，细胞出现梭形成纤维样细胞，大小趋于一致。HE染色观察到大部分细胞呈梭形，体积小，轮廓清晰，细胞核为圆形或卵圆形，体积较大。进行免疫细胞化学染色检测细胞表面抗原，倒置显微镜下STRO-1化学染色阳性表达。提示作为骨组织中软骨修复或软骨化骨修复的种子细胞的可行性。多数实验是通过检测一些特异性标记物来观察SHED体外分化的能力。
4 SHED神经方向分化
王劲松等[7]使用两步诱导法培养SHED，首先将第三代SHED加入神经干特殊的培养基和细胞因子中进行神经球诱导培养，发现其能够形成神经细胞样球体，通过免疫荧光等方法在神经球中观察到神经营养因子的表达，将神经球冰冻切片，免疫荧光染色，倒置显微镜下见神经干中培养的细胞开始聚集，呈现肉眼可见度的球状聚集物，悬浮生长并逐渐变大。免疫荧光鉴定，发现神经营养因子（GDNF）表达呈阳性。证明SHED具有表达和分泌神经营养因子（GDNF）的能力。
5 SHED脂肪方向分化
SHED具有多向分化能力及極高的可塑性，不仅能分化为来源组织的成熟细胞，还能横向分化成不同胚层起源组织的细胞，并出现脂肪细胞特异性标记物过氧化物酶体增殖物激活受体γ2基因的表达。许诺等[8]将分离的SHED培养至第二代时在培养液中加入成脂诱导液（IBMX、Dex、胰岛素、吲哚美辛、庆大霉素），待细胞内成脂滴时终止培养，油红-O染色。倒置显微镜下观察到个别细胞包浆内出现圆形或椭圆形高强度折射点，20天左右可见串珠样透明高亮度点增多，并有部分融合，油红-O染色阳性，提示部分细胞中有脂滴形成。
6 应用展望
人类有二十颗乳牙，因其可以自然脱落方便易得，且无创伤，来源于自体，无免疫排斥反应，具有较高的安全性，SHED已成为临床医学研究的重点。由于其高度增殖能力及多向分化能力，SHED 在治疗骨和牙组织再生修复、神经系统疾病及肌肉萎缩、免疫系统疾病、皮肤外伤、肝脏疾病等方面有广阔的应用前景。作为细胞学研究必不可少的伙伴—生物电镜更成为继续学习与研究的重要方面，掌握好生物电镜技术，可以为我们研究乳牙牙髓干细胞起到重大的推动作用。
参考文献
[1]Miura M， Gronthos S， Zhao M， et al. SHED： stem cells from human exfoliated deciduous teeth[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2003， 100（10）： 5807-5812.
[2]张仲凯， 方琦， 丁铭， 等. 生物电镜技术的应用实践[J]. 云南大学学报 （自然科学版）， 1999， 21： 5-7.
[3]许诺， 陈柯， 申元源. 人乳牙牙髓干细胞的体外培养和鉴定[J]. 南方医科大学学报， 2009， 29（3）： 479-482.
[4]路娟英， 高杰， 麻丹丹， 等. 干细胞因子促进人乳牙牙髓干细胞增殖与向成骨方向分化[J]. 南方医科大学学报， 2011， 31（3）： 531-534.
[5] 陆家瑜， 华丽， 周文锐， 等. 乳牙牙髓干细胞体外诱导成骨细胞的实验研究[J]. 上海口腔医学， 2008， 17（4）： 0-0.
[6]申元源， 陈柯， 许诺. 人乳牙牙髓干细胞体外成骨特性的实验研究[J]. 南方医科大学学报， 2010 （1）： 96-99.
[7]王劲松， 汪璇， 王松灵. 人乳牙牙髓干细胞体外表达和分泌胶质细胞源性神经营养因子的研究[J]. 北京口腔医学， 2011， 19（5）： 245-248