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摘要：目的 通过双荧光素酶技术验证MAP3K1-3UTR基因表达的作用，从而研究凋亡因子对绵羊卵泡闭锁和凋亡的分子机制。方法 根据NCBI在线设计引物获取目的基因，将双荧光素酶载体分别插入MAP3K1基因野生型（MAP3K1-3UTR-WT）和突变型（MAP3K1-3UTR-MU）片段，构建psicheck2-MAP3K1-3UTR-WT和psicheck2-MAP3K1-3UTR-MU双荧光素酶报告质粒，将重组之后的双荧光素酶报告质粒转染293T细胞，检测双荧光素酶的活性。结果 经过酶切和基因测序技术，成功构建MAP3K1-3UTR-WT和MAP3K1-3UTR-MU的双荧光素酶报告质粒。psicheck2-MAP3K1-3UTR野生型与psicheck2-MAP3K1-3UTR突变型相比，荧光素酶活性明显降低。结论 MAP3K1-3UTR基因可能与绵羊卵泡细胞的闭锁和凋亡有关。
关键词：MAP3K1;卵泡颗粒细胞;基因表达;双荧光素酶
引言
卵泡是雌性动物繁殖的重要物质基础，卵泡是由卵母细胞及其周围颗粒细胞（granulosa cells，GCs）组成。颗粒细胞是构成卵泡的最大细胞群，它们以自分泌和旁分泌的方式调节卵泡的生长、发育和成熟，颗粒细胞可被认为是卵泡的支持细胞。颗粒细胞可促进卵巢合成和分泌抑制素、雌激素以及孕激素，为卵母细胞的成熟提供微环境，并维持黄体功能[2，3]。有研究表明，当颗粒细胞能力减弱或凋亡时，激素和生长因子的分泌将减少，甚至发生卵泡闭锁 [4]。
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK家族）调节细胞的生长、分化、凋亡等多种生理病理过程，所有真核细胞都能表达，由三类蛋白激酶MAP3K-MAP2K-MAPK组成。MAP3KS一共有24种（MAP3K1至MAP3K21加上RAF1，BRAF和ARAF） [1]。MAP3K1是其中一种分子量为196-kDa的丝氨酸/苏氨酸激酶，它可以被各种刺激和细胞应激（包括生长因子，细胞因子和微管破坏）激活，这是MAPK家族级联激活第一步[6]。其编码MEKK1蛋白是MAPK信号通路中的重要一员[5]，调控JNK、ERK1/2、P38等信号通路[7，8]。细胞凋亡受到生殖激素、微小RNA（microRNA， miRNA）、细胞因子和凋亡相关因子等因素的影响，其生殖激素（如FSH、褪黑素、E2和LH等）对卵泡发育和凋亡起主要作用。然而，这些凋亡因子对绵羊卵泡闭锁和凋亡有何作用尚不清楚。因此本文通过构建MAP3K1-3UTR基因表达载体来研究其在细胞凋亡中的分子机制。
一、实验目的
构建MAP3K1-3UTR基因的psicheck2-MAP3K1-3UTR表达载体，来研究凋亡因子对绵羊卵泡闭锁和凋亡的分子机制。
二、实验材料与方法
（一）实验材料
靶基因名称：MAP3K1基因。
表达载体：psicheck2载体。
293T细胞株，E.coli DH5α Chemical Competent Cell（上海吉凯基因化学技术有限公司），高糖DMEM、小牛血清（美国Hyclone公司），限制性内切酶（美国NEB公司），ClonExpress TM Ⅱ One Step Cloning Kit（中国南京，Vazyme）， T4 DNA Ligase、PrimeSTAR HS DNA polymerase（日本Takara 公司），POLO deliverer 3000（上海瑞赛生物技术有限公司），TRIzol Reagent（invitrogen），
（二）实验步骤
1.引物设计
针对MAP3K1-3UTR基因的CDS区序列NCBI在线设计并合成PCR 引物（见表1）。
2.目的基因获取化学（化学合成）
根据NCBI上获得的MAP3K1-3UTR基因的CDS区序列，设计并化学合成涵盖psicheck2载体结合位点的MAP3K1基因野生型（MAP3K1-3UTR-WT）和突变型（MAP3K1-3UTR-MU）片段。
3. 双荧光素酶报告基因载体构建
（1）目的基因及目的载体的酶切
将目的基因和目的载体用xhoI和NotI分别进行酶切，酶切体系如下：
37℃酶切4-5小时后，电泳分离酶切片段，可以看到在418bp位置处出现两个特异性条带与目的基因相符，切胶回收目的片段。如圖二
（2）目的片段的与目的载体的连接
使用T4 DNA ligase 连接上述酶切后的PCR产物及目的载体，连接体系如下：
22 ?C连接1小时。将10ul连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含抗性的LB平皿，在37?C下培养过夜。次日，挑取单菌落进行菌落PCR，PCR扩增体系及循环程序如下：
将PCR鉴定呈阳性的克隆接到LB液体培养基中，摇菌过夜，次日抽提质粒。将菌落PCR呈阳性的克隆送测序，并进行序列比对。
4.双荧光素酶载体转染293T细胞
制备293T细胞悬液，接种于12孔培养板，在37℃、5%的CO2培养箱培养至细胞汇合度约为 80%，将psicheck2-MAP3K1-3UTR载体（野生型和突变型）质粒分别转染293T细胞。
三、实验结果
（一）psicheck2载体图谱如下：
（二）目的片段酶切
泳道1：目的片段MAP3K1-wt 酶切;
泳道2：目的片段MAP3K1-mu 酶切;
泳道3：Marker DL5000
（三）重组克隆的菌落PCR鉴定
泳道1：Marker DL2000 泳道2-8：基因全长引物对重组子PCR扩增（MAP3K1-WT）;
泳道9-15：基因全长引物对重组子PCR扩增（MAP3K1-MU）
（四） psicheck2-MAP3K1-3UTR载体对293T细胞的转染效果
48小时后，荧光表达强度趋于稳定状态，在倒置荧光显微镜下观察。psicheck2-MAP3K1-3UTR野生型与psicheck2-MAP3K1-3UTR突变型相比，荧光素酶活性明显降低。
psicheck2-MAP3K1-3UTR载体（野生型）
psicheck2-MAP3K1-3UTR载体（突变型）
四、讨论
卵泡闭锁发生的原因之一是颗粒细胞的凋亡，这在许多动物身上已得到了证实。而卵泡闭锁会对卵巢的发育产生一定的影响，从而影响到动物的繁殖。MAP3K1-3UTR基因指导细胞的生长，分化，迁移，对颗粒细胞是否会发生凋亡产生重要影响。
MAP3K1-3UTR基因所编码的MEKK1蛋白具有重要的生物学功能，是MAPK家族几种传导信号的上游调节因子[9]，几种研究表明MAP3K1-3UTR决定着细胞的命运，双荧光素酶报告数据显示抑制MAP3K1-3UTR基因的表达后，双荧光素酶的活性明显降低，说明该基因能够控制细胞的能力。为之后进一步研究细胞凋亡的分子机制奠定了基础。
参考文献：
[1]Leticia Cuarental，David Sucunza-Sáenz，Lara Vali?o-Rivas，Beatriz Fernandez-Fernandez，Ana Belen Sanz，Alberto Ortiz，Juan José Vaquero，Maria Dolores Sanchez-Ni?o. MAP3K kinases and kidney injury[J]. NEFROLOG?A，2019，39（6）.
[2]金艳梅.颗粒细胞对卵泡发育的影响[J].中国畜牧兽医，2010，37（08）：69-72.
[3]Eppig J J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals.[J]. Reproduction，2001，122（6）.
[4]Manabe Noboru，Goto Yasufumi，Matsuda-Minehata Fuko，Inoue Naoko，Maeda Akihisa，Sakamaki Kazuhiro，Miyano Takashi. Regulation mechanism of selective atresia in porcine follicles： regulation of granulosa cell apoptosis during atresia.[J]. Journal of Reproduction and Development，2004，50（5）.
[5]景瑾，刘莉莉，尤杰，夏婷婷，张进，刘春，朱顺星.Map3k1基因下调对B6小鼠眼睑角质形成细胞增殖和迁移能力的影响[J].重庆医学，2018，47（09）：1165-1168.
[6]Wang Jia，Zuo Jie，Wahafu Alafate，Wang Mao-de，Li Rui-Chun，Xie Wan-Fu. Combined elevation of TRIB2 and MAP3K1 indicates poor prognosis and chemoresistance to temozolomide in glioblastoma.[J]. CNS neuroscience & therapeutics，2019.
[7]Witowsky James A，Johnson Gary L. Ubiquitylation of MEKK1 inhibits its phosphorylation of MKK1 and MKK4 and activation of the ERK1/2 and JNK pathways.[J]. Journal of Biological Chemistry，2002，278（3）.
[8]苏富琴，陈晓光.MEKK1在肿瘤MAPK信号传导通路中作用的研究进展[J].中华肿瘤防治杂志，2009，16（07）：555-558.
[9]郑良凤，王胜洁，吴刘成，刘春，李瑶，邵义祥.MEKK1在B6-Co小鼠胚胎发育过程中的表达[J].黑龙江畜牧兽医，2015（01）：1-4+211.
作者简介：
张雪婷（1999-06-01），河北省石家庄市，单位：西北民族大学，研究方向：动物生殖生理（自然科学类）。
莫荣纤（1999-03-），贵州省凱里市，单位：西北民族大学，研究方向：生殖生理。
通讯作者：张涛杰（1983-12-），甘肃临洮，临床兽医学，西北民族大学。
项目名称：miRNA-let-7b对卵巢癌细胞株SKOV3的增殖的影响以及作用机制
项目编号：XBMU-BYL19140.
关键词：MAP3K1;卵泡颗粒细胞;基因表达;双荧光素酶
引言
卵泡是雌性动物繁殖的重要物质基础，卵泡是由卵母细胞及其周围颗粒细胞（granulosa cells，GCs）组成。颗粒细胞是构成卵泡的最大细胞群，它们以自分泌和旁分泌的方式调节卵泡的生长、发育和成熟，颗粒细胞可被认为是卵泡的支持细胞。颗粒细胞可促进卵巢合成和分泌抑制素、雌激素以及孕激素，为卵母细胞的成熟提供微环境，并维持黄体功能[2，3]。有研究表明，当颗粒细胞能力减弱或凋亡时，激素和生长因子的分泌将减少，甚至发生卵泡闭锁 [4]。
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK家族）调节细胞的生长、分化、凋亡等多种生理病理过程，所有真核细胞都能表达，由三类蛋白激酶MAP3K-MAP2K-MAPK组成。MAP3KS一共有24种（MAP3K1至MAP3K21加上RAF1，BRAF和ARAF） [1]。MAP3K1是其中一种分子量为196-kDa的丝氨酸/苏氨酸激酶，它可以被各种刺激和细胞应激（包括生长因子，细胞因子和微管破坏）激活，这是MAPK家族级联激活第一步[6]。其编码MEKK1蛋白是MAPK信号通路中的重要一员[5]，调控JNK、ERK1/2、P38等信号通路[7，8]。细胞凋亡受到生殖激素、微小RNA（microRNA， miRNA）、细胞因子和凋亡相关因子等因素的影响，其生殖激素（如FSH、褪黑素、E2和LH等）对卵泡发育和凋亡起主要作用。然而，这些凋亡因子对绵羊卵泡闭锁和凋亡有何作用尚不清楚。因此本文通过构建MAP3K1-3UTR基因表达载体来研究其在细胞凋亡中的分子机制。
一、实验目的
构建MAP3K1-3UTR基因的psicheck2-MAP3K1-3UTR表达载体，来研究凋亡因子对绵羊卵泡闭锁和凋亡的分子机制。
二、实验材料与方法
（一）实验材料
靶基因名称：MAP3K1基因。
表达载体：psicheck2载体。
293T细胞株，E.coli DH5α Chemical Competent Cell（上海吉凯基因化学技术有限公司），高糖DMEM、小牛血清（美国Hyclone公司），限制性内切酶（美国NEB公司），ClonExpress TM Ⅱ One Step Cloning Kit（中国南京，Vazyme）， T4 DNA Ligase、PrimeSTAR HS DNA polymerase（日本Takara 公司），POLO deliverer 3000（上海瑞赛生物技术有限公司），TRIzol Reagent（invitrogen），
（二）实验步骤
1.引物设计
针对MAP3K1-3UTR基因的CDS区序列NCBI在线设计并合成PCR 引物（见表1）。
2.目的基因获取化学（化学合成）
根据NCBI上获得的MAP3K1-3UTR基因的CDS区序列，设计并化学合成涵盖psicheck2载体结合位点的MAP3K1基因野生型（MAP3K1-3UTR-WT）和突变型（MAP3K1-3UTR-MU）片段。
3. 双荧光素酶报告基因载体构建
（1）目的基因及目的载体的酶切
将目的基因和目的载体用xhoI和NotI分别进行酶切，酶切体系如下：
37℃酶切4-5小时后，电泳分离酶切片段，可以看到在418bp位置处出现两个特异性条带与目的基因相符，切胶回收目的片段。如圖二
（2）目的片段的与目的载体的连接
使用T4 DNA ligase 连接上述酶切后的PCR产物及目的载体，连接体系如下：
22 ?C连接1小时。将10ul连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含抗性的LB平皿，在37?C下培养过夜。次日，挑取单菌落进行菌落PCR，PCR扩增体系及循环程序如下：
将PCR鉴定呈阳性的克隆接到LB液体培养基中，摇菌过夜，次日抽提质粒。将菌落PCR呈阳性的克隆送测序，并进行序列比对。
4.双荧光素酶载体转染293T细胞
制备293T细胞悬液，接种于12孔培养板，在37℃、5%的CO2培养箱培养至细胞汇合度约为 80%，将psicheck2-MAP3K1-3UTR载体（野生型和突变型）质粒分别转染293T细胞。
三、实验结果
（一）psicheck2载体图谱如下：
（二）目的片段酶切
泳道1：目的片段MAP3K1-wt 酶切;
泳道2：目的片段MAP3K1-mu 酶切;
泳道3：Marker DL5000
（三）重组克隆的菌落PCR鉴定
泳道1：Marker DL2000 泳道2-8：基因全长引物对重组子PCR扩增（MAP3K1-WT）;
泳道9-15：基因全长引物对重组子PCR扩增（MAP3K1-MU）
（四） psicheck2-MAP3K1-3UTR载体对293T细胞的转染效果
48小时后，荧光表达强度趋于稳定状态，在倒置荧光显微镜下观察。psicheck2-MAP3K1-3UTR野生型与psicheck2-MAP3K1-3UTR突变型相比，荧光素酶活性明显降低。
psicheck2-MAP3K1-3UTR载体（野生型）
psicheck2-MAP3K1-3UTR载体（突变型）
四、讨论
卵泡闭锁发生的原因之一是颗粒细胞的凋亡，这在许多动物身上已得到了证实。而卵泡闭锁会对卵巢的发育产生一定的影响，从而影响到动物的繁殖。MAP3K1-3UTR基因指导细胞的生长，分化，迁移，对颗粒细胞是否会发生凋亡产生重要影响。
MAP3K1-3UTR基因所编码的MEKK1蛋白具有重要的生物学功能，是MAPK家族几种传导信号的上游调节因子[9]，几种研究表明MAP3K1-3UTR决定着细胞的命运，双荧光素酶报告数据显示抑制MAP3K1-3UTR基因的表达后，双荧光素酶的活性明显降低，说明该基因能够控制细胞的能力。为之后进一步研究细胞凋亡的分子机制奠定了基础。
参考文献：
[1]Leticia Cuarental，David Sucunza-Sáenz，Lara Vali?o-Rivas，Beatriz Fernandez-Fernandez，Ana Belen Sanz，Alberto Ortiz，Juan José Vaquero，Maria Dolores Sanchez-Ni?o. MAP3K kinases and kidney injury[J]. NEFROLOG?A，2019，39（6）.
[2]金艳梅.颗粒细胞对卵泡发育的影响[J].中国畜牧兽医，2010，37（08）：69-72.
[3]Eppig J J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals.[J]. Reproduction，2001，122（6）.
[4]Manabe Noboru，Goto Yasufumi，Matsuda-Minehata Fuko，Inoue Naoko，Maeda Akihisa，Sakamaki Kazuhiro，Miyano Takashi. Regulation mechanism of selective atresia in porcine follicles： regulation of granulosa cell apoptosis during atresia.[J]. Journal of Reproduction and Development，2004，50（5）.
[5]景瑾，刘莉莉，尤杰，夏婷婷，张进，刘春，朱顺星.Map3k1基因下调对B6小鼠眼睑角质形成细胞增殖和迁移能力的影响[J].重庆医学，2018，47（09）：1165-1168.
[6]Wang Jia，Zuo Jie，Wahafu Alafate，Wang Mao-de，Li Rui-Chun，Xie Wan-Fu. Combined elevation of TRIB2 and MAP3K1 indicates poor prognosis and chemoresistance to temozolomide in glioblastoma.[J]. CNS neuroscience & therapeutics，2019.
[7]Witowsky James A，Johnson Gary L. Ubiquitylation of MEKK1 inhibits its phosphorylation of MKK1 and MKK4 and activation of the ERK1/2 and JNK pathways.[J]. Journal of Biological Chemistry，2002，278（3）.
[8]苏富琴，陈晓光.MEKK1在肿瘤MAPK信号传导通路中作用的研究进展[J].中华肿瘤防治杂志，2009，16（07）：555-558.
[9]郑良凤，王胜洁，吴刘成，刘春，李瑶，邵义祥.MEKK1在B6-Co小鼠胚胎发育过程中的表达[J].黑龙江畜牧兽医，2015（01）：1-4+211.
作者简介：
张雪婷（1999-06-01），河北省石家庄市，单位：西北民族大学，研究方向：动物生殖生理（自然科学类）。
莫荣纤（1999-03-），贵州省凱里市，单位：西北民族大学，研究方向：生殖生理。
通讯作者：张涛杰（1983-12-），甘肃临洮，临床兽医学，西北民族大学。
项目名称：miRNA-let-7b对卵巢癌细胞株SKOV3的增殖的影响以及作用机制
项目编号：XBMU-BYL19140.