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摘要：苹果病毒病在我国广泛发生，已成为限制我国苹果优质高产的关键因素。20世纪80年代曾对其做过详细的调查和研究，但近年来由于各地农业产业结构调整等因素，苹果病毒病的发生特点有了不同程度的变化。为了解目前我国苹果病毒病的发生情况，在我国北方苹果主产区山东、陕西、山西、辽宁、北京和黑龙江6个省市的部分地区采集苹果样品共计267份，经RTPCR检测和扩增产物的克隆与测序分析表明在上述地区采集的样品中，苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果茎痘病毒（ASPV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）的发生率分别为66.7%～100.0%、38.1%～94.1%、4.8%～85.7%和4.8%～48.6%；苹果凹果类病毒（ADFVd）仅在山东的两个果园零星发生；6个省市样品中病毒复合侵染率分别为67.1%、92.1%、75.0%、88.2%、94.1%和76.2%。
关键词：苹果病毒病； 潜隐病毒； 类病毒； 分子检测
中图分类号： S432.1
文献标识码： A
苹果是我国第一大水果，在农民增收致富、推进农业结构调整以及出口创汇等方面起着举足轻重的作用。苹果受病毒侵染后，终生带毒，病毒在树体内增殖，干扰、破坏树体的正常生理机能，导致长势减退、产量下降、品质变劣、不耐贮藏[12]。目前，已在我国发现并鉴定的有苹果花叶病毒（Apple mosaic virus， ApMV）、苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus， ACLSV）、苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus， ASGV）、苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus， ASPV）、苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid， ASSVd）以及苹果凹果类病毒（Apple dimple fruit viroid， ADFVd）[34]。其中，ACLSV、ASGV和ASPV侵染后不表现明显的症状，被称为潜隐性病毒。
苹果病毒病为系统性侵染病害，主要通过嫁接、自然根接与机械接种传播，目前为止没有发现任何昆虫传毒介体[3]。病毒可以对苹果树的生长产生多方面的影响，除了引起树体生长减弱、叶片变小和果实畸形外，还可导致树体急剧衰退、提早枯死或采前落果，甚至绝产。此外，病毒还影响苹果苗木质量，引起砧穗不亲和、苗木根系发育不良以及果实风味变劣，品质下降。与此同时，病毒对苹果根系对土壤营养物质的吸收和利用也产生影响[5]。对苹果产业危害最大的是类病毒，如ASSVd和ADFVd侵染苹果树，在叶片和枝条上均不引起明显症状，但导致果实发生锈果、花脸、果面凹凸不平、果实变小畸形等症状，严重降低苹果经济价值甚至导致绝收。
我国在20 世纪80 年代初，将果树病毒病研究列为国家重点科技攻关项目，许多学者相继对苹果病毒病做了详细的调查和研究[1，68]。近年来，由于各地农业产业结构调整，苹果品种不断更新，栽培面积迅速增长，栽培管理技术及病虫害防治方法不断改进和苗木市场日益混乱等因素，苹果主要病毒病害的结构和发生特点有了不同程度的变化。为了解目前我国苹果病毒病的发生情况，同时为优质苗木繁育、优质果品生产提供依据，2008年至2013年，我们先后从山东、陕西、山西、辽宁、北京和黑龙江6个省市采集总计267个样品，对其进行了3种潜隐病毒以及2种类病毒的检测。
1 材料与方法
1.1 样品采集
2008年至2013年，在山东、陕西、山西、辽宁、北京和黑龙江6个省市主产区果园随机采集苹果枝条、叶片与果实，共267个样品（具体采集地点及数量见表1），装入自封袋整理后保存在4 ℃冰箱中。
1.2 植物总RNA提取
取0.2 g样品（枝条、叶片或果实），按Easy Spin 植物RNA快速提取试剂盒（购自北京博迈德生物公司）说明书提取苹果样品总RNA，于-20 ℃保存备用。
1.3 反转录反应
取苹果样品总RNA 3.5 μL、5×MMLV Buffer 4.0 μL、10 μmol/L随机引物1.0 μL、10 mmol/L dNTPs 1.0 μL、RNA酶抑制剂0.5 μL、200 U/μL MMLV酶0.5 μL，加DEPC处理水至20 μL，42 ℃反应1 h，于-20 ℃保存备用。
1.4 PCR扩增、克隆与测序
检测引物均为已发表引物（表2），由华大基因科技股份有限公司合成。PCR反应体系为反转录产物cDNA 2.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L） 0.5 μL、正向引物（20 μmol/L）0.5 μL、反向引物（20 μmol/L）0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，对应引物适宜退火温度（表2）复性45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后，按DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）说明书回收PCR产物，之后连接到pMD18T克隆载体（购自大连宝生物公司）。阳性克隆经验证后由华大基因科技股份有限公司测序，所得的序列与GenBank中已报道的序列进行比对分析。
2 结果与分析
2.1 病毒的检测
以提取的苹果样品总RNA为模板，利用表2中的引物分别进行检测，结果表明PCR扩增后可以获得与预期的目标片段大小相同的条带（电泳图未列出）。将这些条带进行琼脂糖凝胶回收纯化，克隆到pMD18T载体并进行序列测定，所得序列与GenBank中已报道的序列进行比对分析，结果证明扩增到的片段为目标片段。 2.2 病毒的发生与分布
将2008年至2013年的检测结果统计分析，结果如图1所示，可以看出我国北方苹果主产区病毒病与类病毒病的发生非常普遍，采样地区均不同程度地受到侵染。ACLSV在6个省市的发生率均高于60%，其中山西省的发生率甚至高达100%，已成为我国目前发生最为普遍的苹果病毒。ASGV发生率也普遍较高，除黑龙江的发生率不到50%外，其余省市均高于60%。ASPV和ASSVd的发生率相对较低，但在不同省市间发生率差别较大，在新发展的苹果产区—陕西省，这两种病毒的发生率均高于其他省市。在山东的样品中检测到我国新发生的ADFVd，发生率非常低。在调查检测的6个省市样品中，一种以上病毒的复合侵染发生率均高于60%，其中陕西和北京的样品复合侵染率高于90%。
将不同地区主栽品种的病毒与类病毒的发生情况进行分析可以看出（表3），病毒在不同品种苹果上的发生率存在一定的差异。总体来说，‘富士’、‘王林’的病毒发生率要高于其他品种，且这两个品种的样品中有病毒和类病毒复合侵染的发生。同一品种在不同地区受侵染情况也有所不同，辽宁地区‘富士’苹果上的病毒发生率要明显低于其他地区。‘金红’是黑龙江的主栽品种，能抵抗-30 ℃的低温，由于其所处地理位置特殊，气候寒冷，病毒的发生率较其他品种要低很多。
3 讨论
苹果病毒病为系统性侵染病害，主要经由嫁接等无性繁殖传播，病毒在苹果树体内逐年积累和危害，目前没有有效的药剂，造成了病毒病危害日趋严重的现状。准确掌握我国目前苹果产区的病毒分布情况是有效防控病毒病的基础，对繁育、推广无毒苗木和果品优质高产具有重要的指导意义。经过对山东、陕西、山西、辽宁、北京和黑龙江6个省市部分苹果产区样品采集和室内检测，发现我国北方苹果主产区的病毒病害发生相当严重，ACLSV、ASGV、ASPV、ASSVd的平均侵染率为79.0%、72.5%、49.0%和23.2%。与20世纪80年代苹果病毒病发生情况相比，3种潜隐病毒发生率依旧很高；危害性极强的类病毒发生率明显上升，如ASSVd已成为一些地区苹果减产的首要类病毒病害；发生了新的类病毒（ADFVd）。这些数据表明我国目前苹果病毒病发生普遍，防控形势严峻。虽然目前采集样品的地点和数量有限，但这些数据基本反映了我国北方苹果病毒病的发生情况，也为后续调查提供了参考。
在6个省市中，多种病毒的复合侵染率高，有些地区甚至超过了90.0%，主要原因可能是携带病毒的无性繁殖材料随意嫁接，缺乏有效监管，使得一些没有技术保障的育苗圃生产了大量携带多种病毒的苗木。同时，新的栽培模式的推广（如苹果矮化栽培模式），进一步增加了复合侵染的风险。
鉴于目前同一病毒在不同地区的发生率差异较大，同一地区不同病毒的发生率差异也很大的情况，在种苗繁育、调运过程中要加强检疫，尤其是对危害性极强的类病毒如ASSVd和ADFVd。在我国，ADFVd仅在新疆、山东零星分布[3]，必须采取措施防止其传播和扩散。繁育栽培无毒苗和无毒化栽培管理是健康、高效生产苹果的关键。我国必须加强苹果病毒病的研究、检测和防控等方面工作，建立高效的检测方法、监测手段和相关章程，在加强检疫的同时，要推广无毒苗木的使用，建成政府主导，科研院所及相关企业参与，结合农户生产实践的自上而下的网络模式，提高果树病毒及类病毒病的源头控制能力，有效防止主要果树病毒病的大面积扩散，促进苹果产业健康、快速的发展。
参考文献
[1] 刘福昌，王焕玉.苹果病毒病的研究和防治[J].中国果树，1983（2）：3133.
[2] 王国平，刘福昌.苹果病毒病害的研究进展[J].农牧情报研究，1990（2）：1826.
[3] 王亚南，胡同乐，刘淑香，等.我国苹果病毒病的研究现状[J].安徽农业科学，2010，38（15）：79337936.
[4] Ye T， Chen S Y， Wang R， et al. Identification and molecular characterization of Apple dimple fruit viroid in China [J]. Journal of Plant Pathology， 2013， 95（3）： 637641.
[5] 焦朝霞.河北省苹果潜隐性病毒的分布特征[D].保定：河北农业大学，2010.
[6] 刘福昌.苹果病毒及病毒病害简述[J].中国果树，1980（S1）：7785.
[7] 刘福昌.苹果病毒病的发生和研究现状[J].植物检疫，1984（5）：610.
[8] 王焕玉，刘福昌.苹果潜隐病毒的温室鉴定[J].中国果树，1987（4）：1517.
[9] Candresse T， Lanneau M， Revers F， et al. An immunocapture PCR assay adapted to the detection and the analysis of the molecular variability of the Apple chlorotic leaf spot virus [J]. Acta Horticulturae， 1995， 386： 136147.
[10]怀晓，周颖，张瑞，等.苹果茎沟病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清制备[J].植物保护学报，2010，37（5）：436440.
[11]MacKenzie D J， McLean M A， Mukerji S， et al. Improved RNA extraction from woody plants for the detection of viral pathogens by reverse transcriptionpolymerase chain reaction [J]. Plant Disease， 1997， 81（2）： 222226.
[12]郭瑞，李世访，董雅凤，等.苹果锈果类病毒辽宁分离物的克隆与序列分析[J].植物病理学报，2005，35（5）：472474.
[13]Li R， Mock R， Huang Q， et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCRbased detection of diverse plant pathogens [J]. Journal of Virological Methods， 2008， 154： 4855.
关键词：苹果病毒病； 潜隐病毒； 类病毒； 分子检测
中图分类号： S432.1
文献标识码： A
苹果是我国第一大水果，在农民增收致富、推进农业结构调整以及出口创汇等方面起着举足轻重的作用。苹果受病毒侵染后，终生带毒，病毒在树体内增殖，干扰、破坏树体的正常生理机能，导致长势减退、产量下降、品质变劣、不耐贮藏[12]。目前，已在我国发现并鉴定的有苹果花叶病毒（Apple mosaic virus， ApMV）、苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus， ACLSV）、苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus， ASGV）、苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus， ASPV）、苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid， ASSVd）以及苹果凹果类病毒（Apple dimple fruit viroid， ADFVd）[34]。其中，ACLSV、ASGV和ASPV侵染后不表现明显的症状，被称为潜隐性病毒。
苹果病毒病为系统性侵染病害，主要通过嫁接、自然根接与机械接种传播，目前为止没有发现任何昆虫传毒介体[3]。病毒可以对苹果树的生长产生多方面的影响，除了引起树体生长减弱、叶片变小和果实畸形外，还可导致树体急剧衰退、提早枯死或采前落果，甚至绝产。此外，病毒还影响苹果苗木质量，引起砧穗不亲和、苗木根系发育不良以及果实风味变劣，品质下降。与此同时，病毒对苹果根系对土壤营养物质的吸收和利用也产生影响[5]。对苹果产业危害最大的是类病毒，如ASSVd和ADFVd侵染苹果树，在叶片和枝条上均不引起明显症状，但导致果实发生锈果、花脸、果面凹凸不平、果实变小畸形等症状，严重降低苹果经济价值甚至导致绝收。
我国在20 世纪80 年代初，将果树病毒病研究列为国家重点科技攻关项目，许多学者相继对苹果病毒病做了详细的调查和研究[1，68]。近年来，由于各地农业产业结构调整，苹果品种不断更新，栽培面积迅速增长，栽培管理技术及病虫害防治方法不断改进和苗木市场日益混乱等因素，苹果主要病毒病害的结构和发生特点有了不同程度的变化。为了解目前我国苹果病毒病的发生情况，同时为优质苗木繁育、优质果品生产提供依据，2008年至2013年，我们先后从山东、陕西、山西、辽宁、北京和黑龙江6个省市采集总计267个样品，对其进行了3种潜隐病毒以及2种类病毒的检测。
1 材料与方法
1.1 样品采集
2008年至2013年，在山东、陕西、山西、辽宁、北京和黑龙江6个省市主产区果园随机采集苹果枝条、叶片与果实，共267个样品（具体采集地点及数量见表1），装入自封袋整理后保存在4 ℃冰箱中。
1.2 植物总RNA提取
取0.2 g样品（枝条、叶片或果实），按Easy Spin 植物RNA快速提取试剂盒（购自北京博迈德生物公司）说明书提取苹果样品总RNA，于-20 ℃保存备用。
1.3 反转录反应
取苹果样品总RNA 3.5 μL、5×MMLV Buffer 4.0 μL、10 μmol/L随机引物1.0 μL、10 mmol/L dNTPs 1.0 μL、RNA酶抑制剂0.5 μL、200 U/μL MMLV酶0.5 μL，加DEPC处理水至20 μL，42 ℃反应1 h，于-20 ℃保存备用。
1.4 PCR扩增、克隆与测序
检测引物均为已发表引物（表2），由华大基因科技股份有限公司合成。PCR反应体系为反转录产物cDNA 2.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L） 0.5 μL、正向引物（20 μmol/L）0.5 μL、反向引物（20 μmol/L）0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，对应引物适宜退火温度（表2）复性45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后，按DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）说明书回收PCR产物，之后连接到pMD18T克隆载体（购自大连宝生物公司）。阳性克隆经验证后由华大基因科技股份有限公司测序，所得的序列与GenBank中已报道的序列进行比对分析。
2 结果与分析
2.1 病毒的检测
以提取的苹果样品总RNA为模板，利用表2中的引物分别进行检测，结果表明PCR扩增后可以获得与预期的目标片段大小相同的条带（电泳图未列出）。将这些条带进行琼脂糖凝胶回收纯化，克隆到pMD18T载体并进行序列测定，所得序列与GenBank中已报道的序列进行比对分析，结果证明扩增到的片段为目标片段。 2.2 病毒的发生与分布
将2008年至2013年的检测结果统计分析，结果如图1所示，可以看出我国北方苹果主产区病毒病与类病毒病的发生非常普遍，采样地区均不同程度地受到侵染。ACLSV在6个省市的发生率均高于60%，其中山西省的发生率甚至高达100%，已成为我国目前发生最为普遍的苹果病毒。ASGV发生率也普遍较高，除黑龙江的发生率不到50%外，其余省市均高于60%。ASPV和ASSVd的发生率相对较低，但在不同省市间发生率差别较大，在新发展的苹果产区—陕西省，这两种病毒的发生率均高于其他省市。在山东的样品中检测到我国新发生的ADFVd，发生率非常低。在调查检测的6个省市样品中，一种以上病毒的复合侵染发生率均高于60%，其中陕西和北京的样品复合侵染率高于90%。
将不同地区主栽品种的病毒与类病毒的发生情况进行分析可以看出（表3），病毒在不同品种苹果上的发生率存在一定的差异。总体来说，‘富士’、‘王林’的病毒发生率要高于其他品种，且这两个品种的样品中有病毒和类病毒复合侵染的发生。同一品种在不同地区受侵染情况也有所不同，辽宁地区‘富士’苹果上的病毒发生率要明显低于其他地区。‘金红’是黑龙江的主栽品种，能抵抗-30 ℃的低温，由于其所处地理位置特殊，气候寒冷，病毒的发生率较其他品种要低很多。
3 讨论
苹果病毒病为系统性侵染病害，主要经由嫁接等无性繁殖传播，病毒在苹果树体内逐年积累和危害，目前没有有效的药剂，造成了病毒病危害日趋严重的现状。准确掌握我国目前苹果产区的病毒分布情况是有效防控病毒病的基础，对繁育、推广无毒苗木和果品优质高产具有重要的指导意义。经过对山东、陕西、山西、辽宁、北京和黑龙江6个省市部分苹果产区样品采集和室内检测，发现我国北方苹果主产区的病毒病害发生相当严重，ACLSV、ASGV、ASPV、ASSVd的平均侵染率为79.0%、72.5%、49.0%和23.2%。与20世纪80年代苹果病毒病发生情况相比，3种潜隐病毒发生率依旧很高；危害性极强的类病毒发生率明显上升，如ASSVd已成为一些地区苹果减产的首要类病毒病害；发生了新的类病毒（ADFVd）。这些数据表明我国目前苹果病毒病发生普遍，防控形势严峻。虽然目前采集样品的地点和数量有限，但这些数据基本反映了我国北方苹果病毒病的发生情况，也为后续调查提供了参考。
在6个省市中，多种病毒的复合侵染率高，有些地区甚至超过了90.0%，主要原因可能是携带病毒的无性繁殖材料随意嫁接，缺乏有效监管，使得一些没有技术保障的育苗圃生产了大量携带多种病毒的苗木。同时，新的栽培模式的推广（如苹果矮化栽培模式），进一步增加了复合侵染的风险。
鉴于目前同一病毒在不同地区的发生率差异较大，同一地区不同病毒的发生率差异也很大的情况，在种苗繁育、调运过程中要加强检疫，尤其是对危害性极强的类病毒如ASSVd和ADFVd。在我国，ADFVd仅在新疆、山东零星分布[3]，必须采取措施防止其传播和扩散。繁育栽培无毒苗和无毒化栽培管理是健康、高效生产苹果的关键。我国必须加强苹果病毒病的研究、检测和防控等方面工作，建立高效的检测方法、监测手段和相关章程，在加强检疫的同时，要推广无毒苗木的使用，建成政府主导，科研院所及相关企业参与，结合农户生产实践的自上而下的网络模式，提高果树病毒及类病毒病的源头控制能力，有效防止主要果树病毒病的大面积扩散，促进苹果产业健康、快速的发展。
参考文献
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[6] 刘福昌.苹果病毒及病毒病害简述[J].中国果树，1980（S1）：7785.
[7] 刘福昌.苹果病毒病的发生和研究现状[J].植物检疫，1984（5）：610.
[8] 王焕玉，刘福昌.苹果潜隐病毒的温室鉴定[J].中国果树，1987（4）：1517.
[9] Candresse T， Lanneau M， Revers F， et al. An immunocapture PCR assay adapted to the detection and the analysis of the molecular variability of the Apple chlorotic leaf spot virus [J]. Acta Horticulturae， 1995， 386： 136147.
[10]怀晓，周颖，张瑞，等.苹果茎沟病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清制备[J].植物保护学报，2010，37（5）：436440.
[11]MacKenzie D J， McLean M A， Mukerji S， et al. Improved RNA extraction from woody plants for the detection of viral pathogens by reverse transcriptionpolymerase chain reaction [J]. Plant Disease， 1997， 81（2）： 222226.
[12]郭瑞，李世访，董雅凤，等.苹果锈果类病毒辽宁分离物的克隆与序列分析[J].植物病理学报，2005，35（5）：472474.
[13]Li R， Mock R， Huang Q， et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCRbased detection of diverse plant pathogens [J]. Journal of Virological Methods， 2008， 154： 4855.