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摘 要：以玉米优良品种自交系鲁原92为实验材料，以玉米幼苗胚叶和胚根为外植体，采用正交实验，分析了诱导愈伤组织的若干影响因素。结果表明：2，4-D在诱导愈伤组织中起着关键作用，添加一定浓度的KT对诱导起着促进作用，添加微量的AgNO3明显促进愈伤诱导。
关键词：玉米；胚根；胚叶；组织培养；愈伤组织
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）16-24-03
组织培养是指在无菌条件下利用人工培养基对植物组织进行培养的技术，它是遗传转化、植物改良研究的基本环节之一。目前，国内外从事玉米组培主要是从幼胚诱导出愈伤组织，利用其他部分作外植体进行组织培养取得成功的比较少见，然而用幼胚进行诱导愈伤组织，取材会受生长季节的限制。为此，本实验采用玉米的胚叶和胚根作为外植体，进行组织培养诱导愈伤组织，进而产生再生植株，避免了取材受限制的缺陷，对玉米组织培养研究有着重要意义。
1 材料与方法
1.1 实验材料 接种材料为玉米幼苗的胚叶和胚根，原材料为玉米优良自交系鲁原92。
1.2 实验方法
1.2.1 外植体选择与准备 在无菌操作间，把鲁原92种子放在培养瓶中用无菌水中浸泡30min，倒出水后加入0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒10min，在此过程中需不停搅拌。倒出升汞后加入70%的酒精浸泡搅拌消毒30s，倒出后用无菌水冲洗4～5遍，然后接种在MS基本培养基上，放在30℃的培养箱中进行暗培养。待小苗长至4～5cm时，取出待用。
1.2.2 愈伤组织诱导 在超净工作台上，用消毒过的剪刀取小苗胚根的根尖及胚叶，用消毒过的镊子将其接种到诱导愈伤组织的培养基中。此培养基以MS为基本培养基，1L中加入25g蔗糖、12g琼脂，附加不同激素等共设计了9种不同配方（表1），培养基的pH值控制在5.8～6.2（用NaOH调节pH值）。配制好的培养基要在高压灭菌锅中，121℃下灭菌20min。接种完成后，将接种后的材料分2组，一组放在组培室中，温度为25～30℃，每日光照12h，光照强度为1 600～2 000lx的环境下进行光培养；另一组放入培养箱中，温度调至25～30℃进行暗培养。
2 结果与分析
2.1 不同光照条件对诱导愈伤组织的影响比较 由表2可以看出：在光培养的条件下，胚叶的诱导率明显高于胚根，在暗培养的条件下，胚根的诱导率高于胚叶。由观察得知，光培养产生的愈伤组织表面光滑，呈颗粒状，分散性好，呈淡黄色，而暗培养产生的愈伤组织呈水泡状，质量不高。由此可见，光照环境更利于愈伤组织的产生，这与一般幼胚培养普遍需要暗环境有明显的不同。可能的原因是在光环境下胚叶的细胞分化能力强，有利于形成愈伤组织。
2.2 不同2，4-D浓度对愈伤组织形成的影响比较 9种培养基均可诱导产生愈伤组织。愈伤组织一般有2种，一种表面光滑、透明、疏松呈淡黄色的Ⅱ型愈伤组织，其继代增殖能力非常强；另一种是表面不光滑、不透明、细密、呈白色的Ⅰ型愈伤，其在以后的继代增殖过程中易褐变，不具备再分化的能力，应及早淘汰。在诱导愈伤组织过程中，2，4-D对诱导愈伤组织形成有主导作用。本实验中，不同浓度的2，4-D都可诱导出愈伤组织，说明玉米胚叶和胚根诱导愈伤需要添加一定量的2，4-D。不同的2，4-D浓度下外植体的出愈率列于表3。从表3可知，玉米的胚根、胚叶对2，4-D的反映敏感，当2，4-D的浓度为6.0mg/L时，出愈率最高。说明2，4-D对诱导玉米产生愈伤组织有明显的促进作用，但是高浓度2，4-D虽然能得到较高的出愈率，却导致愈伤的生长状况较差，多呈水泡状，且不能继代，也就是说这种愈伤不具备分化再生能力。因此，本实验认为2，4-D浓度以2mg/L较为适宜。
2.3 不同KT浓度对愈伤组织形成的影响比较 本实验KT设计3个水平，来研究KT对胚叶胚根诱导愈伤的影响，玉米外植体使用不同浓度KT的出愈率列于表4。由表4可知，KT在玉米愈伤形成过程并不是必须的，因为只要有2，4-D存在而不加入KT，诱导率也能达到43.5%，适量添加KT可提高玉米外植体的出愈率，当KT的浓度为0.5mg/L，出愈率最高，但是高浓度的KT会造成诱导愈伤组织能力的下降。所以我们认为加入低浓度的KT对诱导愈伤有一定促进作用，但是浓度不易过高，以0.5mg/L比较适宜，浓度太高不利于愈伤形成。
2.4 不同6-BA浓度对愈伤组织形成的影响比较 玉米外植体使用不同浓度6-BA的出愈率列于表5。由表5可知，6-BA可提高玉米外植体的出愈率，当其浓度为1.0mg/L时出愈率最高。3个水平的6-BA对愈伤组织诱导率影响的差异很小，故6-BA在诱导愈伤过程中作用不是很明显。加入少量0.1mg/L的6-BA，可能对以后愈伤组织的分化有促进作用，这与上海植物生理所卫志明的观点相同，他也认为：虽然6-BA在诱导愈伤中作用不明显，但是以后在愈伤分化中，前期加入6-BA对以后愈伤组织分化有明显促进作用。
2.5 不同AgNO3浓度对愈伤组织形成的影响比较 玉米外植体使用不同浓度AgNO3的出愈率列于表6。由表6可知，AgNO3能显著提高出愈率，在一定浓度范围内，其浓度与出愈率成正相关性。
3 结论与讨论
（1）通过试验发现：在利用鲁原92的胚叶、胚根产生再生植株时，MS+2，4-D2mg/L+KT 0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+AgNO320mg/L是最佳的诱导愈伤组织的培养基。光培养更有利于鲁原92产生愈伤组织。培养基中的L-脯氨酸和水解酪蛋白在诱导过程中起辅助作用。2，4-D的浓度在诱导过程中起主导作用。
（2）污染是组织培养过程中经常遇到的问题，污染率的高低决定了组织培养能否正常进行。污染主要有外植体带菌和各操作环节污染杂菌2条途径。玉米常用70%的乙醇作为外植体表面的杀菌剂，70%的乙（下转27页）（上接25页）醇对细胞有很强的穿透性和杀伤力，灭菌时间不宜过长，约30s即可杀死外植体表面大部分微生物，一般因材料不同控制在5～60s，延长灭菌时间会增加外植体损伤程度。操作环节可通过严格操作来控制，如对培养基、培养皿、镊子等工具彻底灭菌，工作环境定期打扫、熏蒸，超净工作台开启15min后用70%的乙醇擦洗台面；接种的镊子，接完1皿（或1瓶）要消毒1次；操作人员在操作中要经常用70%的乙醇擦洗手部等。
参考文献
[1]张君，王丕武，武丽敏，等.正交试验法在玉米组织培养中的应用[J].玉米科学，2003，11（1）：101-103.
[2]杜何为，张祖新，郑用琏.玉米组织培养体系的研究[J].湖北农业科学，2003（4）：22-24，39.
[3]侯艳华，徐仲，苍晶，等.玉米自交系愈伤组织的诱导及再生[J].吉林农业大学学报，2002，24（6）：7-10.
[4]王景雪，孙毅，胡冬焱，等.激素等在诱导玉米胚叶产生愈伤组织中的作用[J].山西农业大学学报：自然科学版，2002，22（1）：14-17.
[5]孙红炜，尚佑芬，杨崇良，等.影响玉米愈伤组织诱导和植株再生的有关因素研究[J].山东农业科学，2002，6：30-31.
[6]Hall RD.Plant Cell Culture Protocols[J].Humana Press，1999.
[7]傅作申，徐振彪，母秋华.玉米幼胚愈伤组织诱导及植株再生[J].玉米科学，1998，6（3）：32-34.
[8]周洪生.甜玉米胚愈伤组织的诱导、继代、植株再生的研究[J].作物学报，1993，19（1）：55-61.
[9]李慧蓉.2，4-D在玉米幼叶培养中的歧义作用[J].武汉植物学研究，1992，10（2）：152-156.
[10]Hongchang Ma，et al.Direct Generation of Maize Haploids via another culture[J].Cytologia，1991（56）：103-106.
[11]董金皋，刘国胜，黄梧芳.玉米组织培养的进展与技术关键[J].河北农业大学学报，1989，12（3）：155-162.
[12]Vasil V et al.Plant regeneration from friable embryogenic callus and cell suspension culture of Zea mays L[J].J Physiol，1986，126：399-408. （责编：张宏民）
关键词：玉米；胚根；胚叶；组织培养；愈伤组织
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）16-24-03
组织培养是指在无菌条件下利用人工培养基对植物组织进行培养的技术，它是遗传转化、植物改良研究的基本环节之一。目前，国内外从事玉米组培主要是从幼胚诱导出愈伤组织，利用其他部分作外植体进行组织培养取得成功的比较少见，然而用幼胚进行诱导愈伤组织，取材会受生长季节的限制。为此，本实验采用玉米的胚叶和胚根作为外植体，进行组织培养诱导愈伤组织，进而产生再生植株，避免了取材受限制的缺陷，对玉米组织培养研究有着重要意义。
1 材料与方法
1.1 实验材料 接种材料为玉米幼苗的胚叶和胚根，原材料为玉米优良自交系鲁原92。
1.2 实验方法
1.2.1 外植体选择与准备 在无菌操作间，把鲁原92种子放在培养瓶中用无菌水中浸泡30min，倒出水后加入0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒10min，在此过程中需不停搅拌。倒出升汞后加入70%的酒精浸泡搅拌消毒30s，倒出后用无菌水冲洗4～5遍，然后接种在MS基本培养基上，放在30℃的培养箱中进行暗培养。待小苗长至4～5cm时，取出待用。
1.2.2 愈伤组织诱导 在超净工作台上，用消毒过的剪刀取小苗胚根的根尖及胚叶，用消毒过的镊子将其接种到诱导愈伤组织的培养基中。此培养基以MS为基本培养基，1L中加入25g蔗糖、12g琼脂，附加不同激素等共设计了9种不同配方（表1），培养基的pH值控制在5.8～6.2（用NaOH调节pH值）。配制好的培养基要在高压灭菌锅中，121℃下灭菌20min。接种完成后，将接种后的材料分2组，一组放在组培室中，温度为25～30℃，每日光照12h，光照强度为1 600～2 000lx的环境下进行光培养；另一组放入培养箱中，温度调至25～30℃进行暗培养。
2 结果与分析
2.1 不同光照条件对诱导愈伤组织的影响比较 由表2可以看出：在光培养的条件下，胚叶的诱导率明显高于胚根，在暗培养的条件下，胚根的诱导率高于胚叶。由观察得知，光培养产生的愈伤组织表面光滑，呈颗粒状，分散性好，呈淡黄色，而暗培养产生的愈伤组织呈水泡状，质量不高。由此可见，光照环境更利于愈伤组织的产生，这与一般幼胚培养普遍需要暗环境有明显的不同。可能的原因是在光环境下胚叶的细胞分化能力强，有利于形成愈伤组织。
2.2 不同2，4-D浓度对愈伤组织形成的影响比较 9种培养基均可诱导产生愈伤组织。愈伤组织一般有2种，一种表面光滑、透明、疏松呈淡黄色的Ⅱ型愈伤组织，其继代增殖能力非常强；另一种是表面不光滑、不透明、细密、呈白色的Ⅰ型愈伤，其在以后的继代增殖过程中易褐变，不具备再分化的能力，应及早淘汰。在诱导愈伤组织过程中，2，4-D对诱导愈伤组织形成有主导作用。本实验中，不同浓度的2，4-D都可诱导出愈伤组织，说明玉米胚叶和胚根诱导愈伤需要添加一定量的2，4-D。不同的2，4-D浓度下外植体的出愈率列于表3。从表3可知，玉米的胚根、胚叶对2，4-D的反映敏感，当2，4-D的浓度为6.0mg/L时，出愈率最高。说明2，4-D对诱导玉米产生愈伤组织有明显的促进作用，但是高浓度2，4-D虽然能得到较高的出愈率，却导致愈伤的生长状况较差，多呈水泡状，且不能继代，也就是说这种愈伤不具备分化再生能力。因此，本实验认为2，4-D浓度以2mg/L较为适宜。
2.3 不同KT浓度对愈伤组织形成的影响比较 本实验KT设计3个水平，来研究KT对胚叶胚根诱导愈伤的影响，玉米外植体使用不同浓度KT的出愈率列于表4。由表4可知，KT在玉米愈伤形成过程并不是必须的，因为只要有2，4-D存在而不加入KT，诱导率也能达到43.5%，适量添加KT可提高玉米外植体的出愈率，当KT的浓度为0.5mg/L，出愈率最高，但是高浓度的KT会造成诱导愈伤组织能力的下降。所以我们认为加入低浓度的KT对诱导愈伤有一定促进作用，但是浓度不易过高，以0.5mg/L比较适宜，浓度太高不利于愈伤形成。
2.4 不同6-BA浓度对愈伤组织形成的影响比较 玉米外植体使用不同浓度6-BA的出愈率列于表5。由表5可知，6-BA可提高玉米外植体的出愈率，当其浓度为1.0mg/L时出愈率最高。3个水平的6-BA对愈伤组织诱导率影响的差异很小，故6-BA在诱导愈伤过程中作用不是很明显。加入少量0.1mg/L的6-BA，可能对以后愈伤组织的分化有促进作用，这与上海植物生理所卫志明的观点相同，他也认为：虽然6-BA在诱导愈伤中作用不明显，但是以后在愈伤分化中，前期加入6-BA对以后愈伤组织分化有明显促进作用。
2.5 不同AgNO3浓度对愈伤组织形成的影响比较 玉米外植体使用不同浓度AgNO3的出愈率列于表6。由表6可知，AgNO3能显著提高出愈率，在一定浓度范围内，其浓度与出愈率成正相关性。
3 结论与讨论
（1）通过试验发现：在利用鲁原92的胚叶、胚根产生再生植株时，MS+2，4-D2mg/L+KT 0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+AgNO320mg/L是最佳的诱导愈伤组织的培养基。光培养更有利于鲁原92产生愈伤组织。培养基中的L-脯氨酸和水解酪蛋白在诱导过程中起辅助作用。2，4-D的浓度在诱导过程中起主导作用。
（2）污染是组织培养过程中经常遇到的问题，污染率的高低决定了组织培养能否正常进行。污染主要有外植体带菌和各操作环节污染杂菌2条途径。玉米常用70%的乙醇作为外植体表面的杀菌剂，70%的乙（下转27页）（上接25页）醇对细胞有很强的穿透性和杀伤力，灭菌时间不宜过长，约30s即可杀死外植体表面大部分微生物，一般因材料不同控制在5～60s，延长灭菌时间会增加外植体损伤程度。操作环节可通过严格操作来控制，如对培养基、培养皿、镊子等工具彻底灭菌，工作环境定期打扫、熏蒸，超净工作台开启15min后用70%的乙醇擦洗台面；接种的镊子，接完1皿（或1瓶）要消毒1次；操作人员在操作中要经常用70%的乙醇擦洗手部等。
参考文献
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[8]周洪生.甜玉米胚愈伤组织的诱导、继代、植株再生的研究[J].作物学报，1993，19（1）：55-61.
[9]李慧蓉.2，4-D在玉米幼叶培养中的歧义作用[J].武汉植物学研究，1992，10（2）：152-156.
[10]Hongchang Ma，et al.Direct Generation of Maize Haploids via another culture[J].Cytologia，1991（56）：103-106.
[11]董金皋，刘国胜，黄梧芳.玉米组织培养的进展与技术关键[J].河北农业大学学报，1989，12（3）：155-162.
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