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摘要：为了提高奶牛体外受精效果，研究了体外成熟卵母细胞在IVF-100、BO、TALP 3种体外受精液中的受精效果，同时比较了裸卵（NOs）与卵丘卵母细胞复合体（COCs）对受精效果的影响。结果显示，体外成熟卵母细胞在受精液IVF-100中的卵裂率显著高于BO液（P<0.05），而TALP液中的卵裂率与IVF-100和BO液的差异都不顯著（P>0.05）；裸卵（NOs）的卵裂率低于卵丘卵母细胞复合体（COCs），但差异不显著（P>0.05）；NOs的囊胚率极显著低于COCs（P<0.01）。不同受精液及有无卵丘细胞对卵母细胞的体外受精效果有明显的影响。
关键词：奶牛；卵母细胞；体外受精；卵裂率；囊胚率
中图分类号： S823.9 13文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）15-0137-02
随着配子与胚胎生物技术的研究与应用，对胚胎的需求量越来越大。超数排卵和胚胎移植的合理化应用虽能成倍提高优良母畜的繁殖率，但所获得的胚胎数量有限。为了解决这个问题，近年来国内外对奶牛卵母细胞体外受精技术进行了大量的研究。保国俊等通过体外受精技术提供了更多数量、更低成本的胚胎[1-2]，IVF技术是对品种优良的公畜、母畜发挥出超常繁殖能力的一种应用。
由于体外受精技术操作环节十分复杂，影响结果因素较多，且卵母细胞在体外的生长繁殖对生存环境要求特别高，易导致试验体系不够稳定，从而对试验结果的准确性造成很大影响[3-4]。本研究通过对比3种受精液对卵母细胞体外受精效果的研究，以其为基础来研制出更好的受精液，进而加快我国奶牛业的发展，提高经济效益。裸卵和卵丘卵母细胞体外受精后，都可以发育到囊胚阶段，但裸卵的囊胚率显著低于卵丘卵母细胞的囊胚率。通过对比2种卵母细胞的囊胚率，对体外受精时卵母细胞的筛选起着重要作用。本试验就不同受精液、不同形态的卵子对奶牛成熟卵母细胞体外受精能力的影响进行了研究，皆在为优化奶牛体外受精提供参考依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1卵巢的采集与保存
本试验所用奶牛卵巢来自河南省郑州市郊个体屠宰场。屠宰后立即采集卵巢并除去多余的脂肪组织，然后用加有双抗的生理盐水冲洗5～6次，保存在装有37 ℃左右、加有双抗的灭菌生理盐水中，于2～3 h内带回实验室。
1.1.2主要试剂
胎牛血清（FBS）（Biotech，P40-47500）；肝素钠（Sigma，H3149-25KU）；石蜡油（Sigma）；TCM-199（Gibco）；NaCl（Sigma，S-5886）；KCl（Sigma，P-5405）；NaH2CO3（Sigma，S-5761）；NaH2PO4（Sigma，RDD007）；CaCl2·2H2O（Sigma，C-5080）。
1.2试验方法
抽吸法：用无菌纱布将卵巢表面擦干，抽吸法吸取直径 2～8 mm的卵泡，抽吸液注入培养皿中，挑选裸卵、半裸卵及具有3层及其以上卵丘的卵丘-卵母细胞复合体（cumulus oocyte complexes，COCs）用于试验。
1.3卵母细胞分级标准
根据包被卵母细胞的卵丘细胞完整性、卵丘细胞层数以及卵母细胞的胞质均匀性将卵母细胞分为4级：A级，卵丘细胞3层以上，胞质均匀；B级，1～2层卵丘细胞，胞质均匀；C级，裸卵，卵丘细胞不完整；D级是死亡或退化的卵母细胞。A、B级卵母细胞为可用卵母细胞。
1.4卵母细胞体外成熟培养
将收集的卵母细胞用成熟液洗3遍，然后每40～60个移入平衡至少2 h的1 mL成熟液中（四孔板），于5%CO2、95%空气、38.5 ℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养23～24 h。若卵丘细胞共培养则用微滴法（100 μL），以排出第一极体为卵母细胞成熟的标志[5]。
1.5卵母细胞的体外受精
受精液为IVF-100或BO液时运用直接离心法对精子进行洗涤，即用6 mL洗精液稀释解冻的精液并于2 000 r/min下离心7 min，弃去上清液，重复1次后用受精液稀释精子，密度为1×106～6×106 个/mL，然后放入CO2培养箱中备用。受精液为TALP液时则用上浮法对精子进行30～60 min的孵化，然后再离心洗涤。将23～24 h成熟的卵母细胞于受精液中洗3遍，并用1 mL移液管将卵丘细胞部分去除。每10枚左右卵子移入平衡2 h的覆有石蜡油的50 μL受精微滴中，加入50 μL精液后于CO2培养箱中进行受精。IVF-100受精时间为6 h，BO液受精时间为8 h，TALP液受精时间为18 h。
1.6卵母细胞体外成熟判定
卵丘-卵母细胞成熟培养22～24 h后，主要通过在显微镜下观察卵母细胞的形态来判断卵母细胞是否成熟。正常成熟的卵母细胞细胞质均匀，没有空泡，其周围的卵丘细胞发生扩展。卵丘细胞扩展常用作判断卵母细胞体外成熟的特征。将培养成熟的卵母细胞放入含有0.1%透明质酸酶的成熟培养液中，在CO2培养箱中孵育10 min后用吸胚管轻轻吹打以脱去卵丘细胞，将裸卵在体视显微镜下镜检，含有第一极体的判为成熟[6]。若卵周隙明显变大，细胞质中有空泡出现，判定已经开始退化。
1.7统计分析
用SPSS 11.0统计软件进行数据的整理与分析。
2结果与分析
2.1不同受精液对受精卵卵裂的效果
将经体外成熟的卵母细胞随机移入3种不同的受精微滴（即TVF-100、BO液和TALP液）中受精。受精后进行胚胎的体外培养，从受精开始算起48 h对各组的卵裂情况进行统计分析。从表1可以看出，用IVF-100作为受精液，其体外受精48 h后的卵裂率显著高于BO液的卵裂率（P<0.05），而以TALP液作为受精液，其卵裂率与其他组无差异。说明不同的受精液对卵裂有显著影响，从卵母细胞卵裂率来看，IVF-100作为受精液显著优于BO液和TALP液2种受精液。 2.2卵丘细胞对卵母细胞受精及受精后胚胎体外发育的效果
选取成熟的裸卵（NOs）和成熟的卵丘卵母细胞（COCs）进行体外受精，并用IVF-100受精液稀释精子，受精后进行胚胎的体外培养，从受精开始算起48 h对各组的卵裂情况进行统计分析。从表2可以看出，虽然COCs的卵裂率高于自然裸卵，但差异并不显著（P>0.05），而其囊胚率极显著高于COCs的（P<0.01）。表明卵丘细胞对卵母细胞受精后体外发育的影响要远高于对卵母细胞受精的影响。
3讨论
3.1不同受精液对奶牛卵母细胞体外受精的影响
影响卵母细胞体外受精的因素很多[6]，受精液及其成分以及卵母细胞的形态是主要因素。本试验对比了3种不同的受精液对卵母细胞体外受精效果的影响，BO液和TALP液为目前经典的2种受精液，这些溶液相对比较简单，主要成分是无机盐离子，不含复杂的氨基酸和维生素等成分。IVF-100为商品化的受精液，基础液为BO液，效果稳定而且效率较高，对于成熟良好的卵母细胞受精率一般高达80%～90%。由于其价格较高，常用于活体取得的卵子体外受精或其他特殊卵子的体外受精试验中[7]。试验结果显示，IVF-100作为受精液时的卵裂率显著高于BO液的（P<0.05），虽然在數值上表现出高于TALP液的趋势，但统计检验差异不显著。同时TALP液与BO液的卵裂率也无明显差异。不同受精液对试验结果有着明显的影响。这表明IVF-100在促进受精卵的卵裂上的作用要强于BO液，同时也说明BO液作为体外受精液还存在巨大的改进空间。BO液对精子的作用比较强烈，因而与受精卵共孵化的时间不能过长。相比之下TALP液对精子的作用就比较温和些，与本试验结果相同，许多试验显示其虽然在数值上有高于BO液的趋势但统计结果无差异。而且一些试验结果表明其对胚胎发育效果不如BO液[8-9]，由于这方面受受精时间、卵丘细胞、精子的洗涤等许多因素的制约，其机制仍有待探索。就总体而言，成熟良好的卵母细胞不管用于何种受精液，其受精卵的卵裂率都较高，但IVF-100对受精卵卵裂的促进作用要强于其他受精液。IVP技术作为一个整体，各个环节精密相关，因而要想得到较多的可移植胚，一个相对较好的受精环节是必须的。
3.2有无卵丘细胞对卵母细胞体外受精效果的影响
本研究在自然裸卵与COCs经体外成熟后，对其体外受精的卵裂率及囊胚发育率进行了比较。结果显示，自然裸卵的卵裂率显著低于COCs的，并且囊胚发育率的差异达到了极显著水平。李荣凤等试验结果也表明，个别自然裸卵是能够发育到囊胚的[10]。Yang等研究表明，卵母细胞成熟过程中的许多机制都需要通过卵丘细胞来完成，自然裸卵经体外成熟培养后虽然部分能排出第一极体，但没有继续发育的潜力[11]。本研究并不排除个别特殊卵母细胞的存在，但其原因仍有待进一步探索。
4结论
体外成熟卵母细胞在受精液IVF-100中的卵裂率优于BO液与TALP液。裸卵（NOs）的卵裂率低于卵丘卵母细胞复合体（COCs），但差异不显著；NOs能够发育到囊胚阶段，但囊胚率极显著低于COCs的。
参考文献：
[1]保国俊. 牛卵母细胞体外受精和培养技术[J]. 畜牧兽医杂志，2010，29（1）：34-36.
[2]Ginther O J，Kastelic J P，Knopf L. Composition and characteristics of follicular waves during the bovine estrous cycle[J]. Animal Reproduction Science，1989，20（3）：187-200.
[3]Brackett B G，Bousquet D，Boice M L，et al. Normal development following in vitro fertilization in the cow[J]. Biology of Reproduction，1982，27（1）：147-158.
[4]刘新峰，郝志明，史远刚，等. 不同培养体系对牛卵母细胞体外受精的影响[J]. 安徽农业科学，2011，39（2）：1049-1050.
[5]肖西山，齐军喆，付静涛，等. FSH剂量对绒山羊超数排卵效果的研究[J]. 黑龙江动物繁殖，2009，17（6）：15-16.
[CM（29][6]桑润滋. 动物繁殖生物技术[M]. 2版.北京：中国农业出版社，[ZK）]
2006：328-330.
[7]马学海，王安江，张居农. 关于影响性控精子体外受精的因素及应用前景展望[J]. 中国奶牛，2007（5）：28-30.
[8]晁生玉，赵鑫，巴文胜，等. 利用腹腔镜技术观察发情藏羊黄体的研究[J]. 中国草食动物，2009，29（6）：6-8.
[9]穆春雨. 影响牛体外受精若干因素的研究及性控精液体外受精初探[D]. 武汉：华中农业大学，2007.
[10]李荣凤，薛晓先，刘哲. 牛卵母细胞皮层颗粒荧光染色法成熟鉴定[J]. 畜牧兽医学报，2000，31（3）：203-210.
[11]Yang N S，Lu K H，Gordon I. In vitro fertilization（IVF） and culture（IVC） of bovine oocytes from stored ovaries[J]. Theriogenology，1990，33（1）：352.
关键词：奶牛；卵母细胞；体外受精；卵裂率；囊胚率
中图分类号： S823.9 13文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）15-0137-02
随着配子与胚胎生物技术的研究与应用，对胚胎的需求量越来越大。超数排卵和胚胎移植的合理化应用虽能成倍提高优良母畜的繁殖率，但所获得的胚胎数量有限。为了解决这个问题，近年来国内外对奶牛卵母细胞体外受精技术进行了大量的研究。保国俊等通过体外受精技术提供了更多数量、更低成本的胚胎[1-2]，IVF技术是对品种优良的公畜、母畜发挥出超常繁殖能力的一种应用。
由于体外受精技术操作环节十分复杂，影响结果因素较多，且卵母细胞在体外的生长繁殖对生存环境要求特别高，易导致试验体系不够稳定，从而对试验结果的准确性造成很大影响[3-4]。本研究通过对比3种受精液对卵母细胞体外受精效果的研究，以其为基础来研制出更好的受精液，进而加快我国奶牛业的发展，提高经济效益。裸卵和卵丘卵母细胞体外受精后，都可以发育到囊胚阶段，但裸卵的囊胚率显著低于卵丘卵母细胞的囊胚率。通过对比2种卵母细胞的囊胚率，对体外受精时卵母细胞的筛选起着重要作用。本试验就不同受精液、不同形态的卵子对奶牛成熟卵母细胞体外受精能力的影响进行了研究，皆在为优化奶牛体外受精提供参考依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1卵巢的采集与保存
本试验所用奶牛卵巢来自河南省郑州市郊个体屠宰场。屠宰后立即采集卵巢并除去多余的脂肪组织，然后用加有双抗的生理盐水冲洗5～6次，保存在装有37 ℃左右、加有双抗的灭菌生理盐水中，于2～3 h内带回实验室。
1.1.2主要试剂
胎牛血清（FBS）（Biotech，P40-47500）；肝素钠（Sigma，H3149-25KU）；石蜡油（Sigma）；TCM-199（Gibco）；NaCl（Sigma，S-5886）；KCl（Sigma，P-5405）；NaH2CO3（Sigma，S-5761）；NaH2PO4（Sigma，RDD007）；CaCl2·2H2O（Sigma，C-5080）。
1.2试验方法
抽吸法：用无菌纱布将卵巢表面擦干，抽吸法吸取直径 2～8 mm的卵泡，抽吸液注入培养皿中，挑选裸卵、半裸卵及具有3层及其以上卵丘的卵丘-卵母细胞复合体（cumulus oocyte complexes，COCs）用于试验。
1.3卵母细胞分级标准
根据包被卵母细胞的卵丘细胞完整性、卵丘细胞层数以及卵母细胞的胞质均匀性将卵母细胞分为4级：A级，卵丘细胞3层以上，胞质均匀；B级，1～2层卵丘细胞，胞质均匀；C级，裸卵，卵丘细胞不完整；D级是死亡或退化的卵母细胞。A、B级卵母细胞为可用卵母细胞。
1.4卵母细胞体外成熟培养
将收集的卵母细胞用成熟液洗3遍，然后每40～60个移入平衡至少2 h的1 mL成熟液中（四孔板），于5%CO2、95%空气、38.5 ℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养23～24 h。若卵丘细胞共培养则用微滴法（100 μL），以排出第一极体为卵母细胞成熟的标志[5]。
1.5卵母细胞的体外受精
受精液为IVF-100或BO液时运用直接离心法对精子进行洗涤，即用6 mL洗精液稀释解冻的精液并于2 000 r/min下离心7 min，弃去上清液，重复1次后用受精液稀释精子，密度为1×106～6×106 个/mL，然后放入CO2培养箱中备用。受精液为TALP液时则用上浮法对精子进行30～60 min的孵化，然后再离心洗涤。将23～24 h成熟的卵母细胞于受精液中洗3遍，并用1 mL移液管将卵丘细胞部分去除。每10枚左右卵子移入平衡2 h的覆有石蜡油的50 μL受精微滴中，加入50 μL精液后于CO2培养箱中进行受精。IVF-100受精时间为6 h，BO液受精时间为8 h，TALP液受精时间为18 h。
1.6卵母细胞体外成熟判定
卵丘-卵母细胞成熟培养22～24 h后，主要通过在显微镜下观察卵母细胞的形态来判断卵母细胞是否成熟。正常成熟的卵母细胞细胞质均匀，没有空泡，其周围的卵丘细胞发生扩展。卵丘细胞扩展常用作判断卵母细胞体外成熟的特征。将培养成熟的卵母细胞放入含有0.1%透明质酸酶的成熟培养液中，在CO2培养箱中孵育10 min后用吸胚管轻轻吹打以脱去卵丘细胞，将裸卵在体视显微镜下镜检，含有第一极体的判为成熟[6]。若卵周隙明显变大，细胞质中有空泡出现，判定已经开始退化。
1.7统计分析
用SPSS 11.0统计软件进行数据的整理与分析。
2结果与分析
2.1不同受精液对受精卵卵裂的效果
将经体外成熟的卵母细胞随机移入3种不同的受精微滴（即TVF-100、BO液和TALP液）中受精。受精后进行胚胎的体外培养，从受精开始算起48 h对各组的卵裂情况进行统计分析。从表1可以看出，用IVF-100作为受精液，其体外受精48 h后的卵裂率显著高于BO液的卵裂率（P<0.05），而以TALP液作为受精液，其卵裂率与其他组无差异。说明不同的受精液对卵裂有显著影响，从卵母细胞卵裂率来看，IVF-100作为受精液显著优于BO液和TALP液2种受精液。 2.2卵丘细胞对卵母细胞受精及受精后胚胎体外发育的效果
选取成熟的裸卵（NOs）和成熟的卵丘卵母细胞（COCs）进行体外受精，并用IVF-100受精液稀释精子，受精后进行胚胎的体外培养，从受精开始算起48 h对各组的卵裂情况进行统计分析。从表2可以看出，虽然COCs的卵裂率高于自然裸卵，但差异并不显著（P>0.05），而其囊胚率极显著高于COCs的（P<0.01）。表明卵丘细胞对卵母细胞受精后体外发育的影响要远高于对卵母细胞受精的影响。
3讨论
3.1不同受精液对奶牛卵母细胞体外受精的影响
影响卵母细胞体外受精的因素很多[6]，受精液及其成分以及卵母细胞的形态是主要因素。本试验对比了3种不同的受精液对卵母细胞体外受精效果的影响，BO液和TALP液为目前经典的2种受精液，这些溶液相对比较简单，主要成分是无机盐离子，不含复杂的氨基酸和维生素等成分。IVF-100为商品化的受精液，基础液为BO液，效果稳定而且效率较高，对于成熟良好的卵母细胞受精率一般高达80%～90%。由于其价格较高，常用于活体取得的卵子体外受精或其他特殊卵子的体外受精试验中[7]。试验结果显示，IVF-100作为受精液时的卵裂率显著高于BO液的（P<0.05），虽然在數值上表现出高于TALP液的趋势，但统计检验差异不显著。同时TALP液与BO液的卵裂率也无明显差异。不同受精液对试验结果有着明显的影响。这表明IVF-100在促进受精卵的卵裂上的作用要强于BO液，同时也说明BO液作为体外受精液还存在巨大的改进空间。BO液对精子的作用比较强烈，因而与受精卵共孵化的时间不能过长。相比之下TALP液对精子的作用就比较温和些，与本试验结果相同，许多试验显示其虽然在数值上有高于BO液的趋势但统计结果无差异。而且一些试验结果表明其对胚胎发育效果不如BO液[8-9]，由于这方面受受精时间、卵丘细胞、精子的洗涤等许多因素的制约，其机制仍有待探索。就总体而言，成熟良好的卵母细胞不管用于何种受精液，其受精卵的卵裂率都较高，但IVF-100对受精卵卵裂的促进作用要强于其他受精液。IVP技术作为一个整体，各个环节精密相关，因而要想得到较多的可移植胚，一个相对较好的受精环节是必须的。
3.2有无卵丘细胞对卵母细胞体外受精效果的影响
本研究在自然裸卵与COCs经体外成熟后，对其体外受精的卵裂率及囊胚发育率进行了比较。结果显示，自然裸卵的卵裂率显著低于COCs的，并且囊胚发育率的差异达到了极显著水平。李荣凤等试验结果也表明，个别自然裸卵是能够发育到囊胚的[10]。Yang等研究表明，卵母细胞成熟过程中的许多机制都需要通过卵丘细胞来完成，自然裸卵经体外成熟培养后虽然部分能排出第一极体，但没有继续发育的潜力[11]。本研究并不排除个别特殊卵母细胞的存在，但其原因仍有待进一步探索。
4结论
体外成熟卵母细胞在受精液IVF-100中的卵裂率优于BO液与TALP液。裸卵（NOs）的卵裂率低于卵丘卵母细胞复合体（COCs），但差异不显著；NOs能够发育到囊胚阶段，但囊胚率极显著低于COCs的。
参考文献：
[1]保国俊. 牛卵母细胞体外受精和培养技术[J]. 畜牧兽医杂志，2010，29（1）：34-36.
[2]Ginther O J，Kastelic J P，Knopf L. Composition and characteristics of follicular waves during the bovine estrous cycle[J]. Animal Reproduction Science，1989，20（3）：187-200.
[3]Brackett B G，Bousquet D，Boice M L，et al. Normal development following in vitro fertilization in the cow[J]. Biology of Reproduction，1982，27（1）：147-158.
[4]刘新峰，郝志明，史远刚，等. 不同培养体系对牛卵母细胞体外受精的影响[J]. 安徽农业科学，2011，39（2）：1049-1050.
[5]肖西山，齐军喆，付静涛，等. FSH剂量对绒山羊超数排卵效果的研究[J]. 黑龙江动物繁殖，2009，17（6）：15-16.
[CM（29][6]桑润滋. 动物繁殖生物技术[M]. 2版.北京：中国农业出版社，[ZK）]
2006：328-330.
[7]马学海，王安江，张居农. 关于影响性控精子体外受精的因素及应用前景展望[J]. 中国奶牛，2007（5）：28-30.
[8]晁生玉，赵鑫，巴文胜，等. 利用腹腔镜技术观察发情藏羊黄体的研究[J]. 中国草食动物，2009，29（6）：6-8.
[9]穆春雨. 影响牛体外受精若干因素的研究及性控精液体外受精初探[D]. 武汉：华中农业大学，2007.
[10]李荣凤，薛晓先，刘哲. 牛卵母细胞皮层颗粒荧光染色法成熟鉴定[J]. 畜牧兽医学报，2000，31（3）：203-210.
[11]Yang N S，Lu K H，Gordon I. In vitro fertilization（IVF） and culture（IVC） of bovine oocytes from stored ovaries[J]. Theriogenology，1990，33（1）：352.