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摘要： 植物显微表型主要是指植物组织、细胞和亚细胞水平的表型信息，是植物表型组学研究的重要组成部分。针对传统籽粒显微性状检测方法效率低、误差大且指标单一等问题，本研究利用Micro-CT扫描技术对5种类型11个品种玉米籽粒开展显微表型精准鉴定研究。基于对CT序列图像的处理解析，共获取籽粒、胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔和胚空腔的34项显微表型指标。其中，胚乳空腔表面积、籽粒体积、胚乳体积比和胚乳空腔比表面积等4项表型指标在不同类型玉米间差异显著（P-value<0.05）。普通玉米胚乳空腔表面积和籽粒体积显著大于其它类型玉米，高油玉米胚乳空腔比表面积最大，甜玉米胚乳空腔比表面积最小，爆裂玉米胚乳体积比最大。进一步利用34项玉米籽粒表型指标开展差异分析和聚类分析，可将11个不同品种玉米分为四类，其中第一类以普通玉米为主，第二类以爆裂玉米为主，第三类是甜玉米，第四类是高油玉米。结果表明，Micro-CT扫描技术不仅可以实现玉米籽粒显微表型的精准鉴定，还可以为玉米籽粒分类、品种检测等提供技术支撑。
关键词： 植物表型组学;显微表型;Micro-CT;玉米籽粒;表型鉴定
中图分类号： S126 文献标志码： A 文章编号： 202103-SA004
引用格式：赵欢， 王璟璐， 廖生进， 张颖， 卢宪菊， 郭新宇， 赵春江. 基于Micro-CT的玉米籽粒显微表型特征研究[J]. 智慧农业（中英文）， 2021， 3 （1）： 16-28.
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1 引 言
进入21世纪以来，随着新一代信息技术迅速发展，大数据时代及育种4.0[1]的到来，使得农业科学从传统的理论科学、实验科学和计算科学转向数据密集型知识发现研究的科学发展阶段，推动作物科学进入以大數据为核心的组学研究时代[2]。进入组学研究时代的农业基础研究，迫切需要借助先进的信息化手段和自动化、高通量的表型获取与解析平台，打破传统作物表型鉴定和分析技术的限制，从组学研究高度深入挖掘“表型—基因型—环境型”内在关系研究[2]，从而更好地为植物功能基因组学和作物分子育种研究服务[3]。
植物表型已在作物育种[4]、分子生物学[5]和微生物学[6]等多个领域中得到广泛应用。Tardieu等[7]将植物表型定义为反映植物结构和组成的，或反映植物生长发育过程和结果的受基因型和环境互作产生的全部或部分可辨识特征和性状。赵春江[2]对植物表型进行更为系统、全面的总结，即植物表型是指能够反映植物细胞、组织、器官、植株和群体结构及功能的物理、生理和生化性状。植物表型涉及范围广，小到核苷酸序列，大到植株群体[8-10]，都属于植物表型的研究范畴。
显微表型是植物表型的重要组成部分，是指在植物组织、细胞和亚细胞层面上能反映植株内部和生化的特征和性状[2]，在特异基因精准鉴定和功能预测上能够发挥重要作用。但相对于器官、植株和群体水平的表型信息获取与解析，显微表型相关工作相对较少、发展相对滞后。如何全面、快速获得植物基于组织细胞的表型信息，是植物表型组学的重要研究内容。针对传统显微表型研究存在的问题，构建现代显微表型研究技术是满足当前植物表型组学尤其是显微表型精准鉴定的关键。
以X射线扫描技术等为代表的新的成像技术极大促进了植物表型组学和植物发育生物学的发展。X射线电子计算机断层扫描——Micro-CT，是一种三维断层扫描成像技术，根据植物不同组织对X射线吸收和透过率的差异，重建获得植物组织的断面或立体图像[11]。Micro-CT最初应用于医学研究，后因为其具有非侵入性、非破坏性和高分辨率等特点，近几年被逐渐引用到农业领域中并得到高度关注。在玉米研究中，基于Micro-CT扫描技术可以从显微水平对玉米表型进行鉴定和功能研究，如提取玉米根系导管三维信息研究其与植物抗旱性的关系[12]，获取茎秆维管束信息研究其与抗倒伏性的关系[13，14]等。将CT图像与图像自动处理软件相结合，可实现玉米显微表型数据的高通量获取和解析，进而与基因组数据相结合进行关联分析，挖掘显微表型相关的候选基因[11]，实现多组学间的交叉融合。
玉米籽粒作为决定玉米产量的重要“库”，内部含有淀粉、蛋白质、脂肪、水溶性多糖、维生素、矿物质以及人体必需的氨基酸等多种生理活性物质[15]。根据玉米植物学特征和生物学特性，可将玉米籽粒划分为多种类型。如根据特殊用途和利用价值，玉米籽粒可被划分为普通玉米和特种玉米，其中特种玉米包含甜玉米、糯玉米、高油玉米和爆裂玉米等多种类型[16-19]。玉米籽粒主要由胚、胚乳和种皮构成，近几年研究还发现了玉米籽粒空腔的存在。根据其分布位置不同，空腔又被详细划分胚空腔、胚乳空腔和皮下空腔[20]。传统玉米籽粒表型获取分析方法主要分为两大类，一是利用考种仪获取玉米籽粒的常规RGB图像并对其进行分析，能得到籽粒的长度、宽度、厚度和密度等外部形态特征表型参数，以及籽粒颜色纹理特征[21]。同Micro-CT相比，获得样品颜色纹理特征是常规RGB图像具备的显著优势，但其也具有不可忽略的局限性，即基于考种RGB图像无法提供籽粒内部形态特征，实现籽粒内部结构研究。二是制作籽粒石蜡切片，在光学显微镜下观察籽粒形态结构并拍摄图像，利用相关算法将多个切片图像进行叠加从而取得整个籽粒的表型特征。虽然采用“切片+显微镜”观察能获得籽粒内部形态结构特征，但是切片制备过程复杂，会出现人工和机械误差，使得获取的序列图像出现如位置偏移等诸多问题，进而导致基于切片图像的三维重构和可视化效果较差[22]。此外，籽粒切片处理后，籽粒完整性受到严重破坏，无法用于后续研究。基于X射线断层扫描技术的植物作物学组织研究方法克服了传统制片的复杂过程，实现了无损、三维的组织成像结果及三维表型的定量分析。Rousseau等[23]首次采用同步辐射X射线同轴成像显微技术研究玉米籽粒的三维解剖结构，并通过调节图像阈值和主动轮廓算法（Active Contour Method）进行籽粒种皮、珠心、胚乳和胚等结构的分割，验证了X射线断层扫描技术能够快速获取植物组织的空间结构和分割组织内部不同的结构信息;Guelpa等[24，25]利用uCT扫描估计粉质胚乳和硬质胚乳的真实密度以及整颗籽粒的密度，结合空腔比值和孔隙率实现了玉米籽粒硬度分类和品质分级;Shao等[26]基于Micro-CT获取的玉米籽粒三维图像发现玉米籽粒密度、孔隙度等表型特征与种子饱满度分级密切相关。但是目前关于利用Micro-CT对不同类型玉米籽粒显微表型特征进行研究的报道尚不多见。 本研究以常见5种类型的11个品种玉米籽粒作为研究对象，研究基于Micro-CT的玉米籽粒显微表型精准鉴定方法，探究不同类型籽粒显微性状特征差异，以期为籽粒分类、品质检测提供依据。
2 试验材料与方法
2.1 试验材料
选取常见5种类型的11个品种玉米籽粒作为研究对象，分别为普通玉米：B73，丹599，京92，京724，MC01;爆裂玉米：830和105;糯玉米：京黄糯269和京科糯2016;甜玉米：京科甜608;高油玉米：RY732。每个品种选取3颗生长发育一致的籽粒用于后续CT扫描。
2.2 籽粒CT扫描
利用X-射线显微CT系统（美国Bruker公司，SkyScan 1172型）对玉米籽粒进行CT扫描。扫描电压为40 kV，电流为250 uA，扫描像素间隔设置为13.55 um，样品距光源和相机距光源的距离分别为259.850 mm和345.591 mm，扫描模式为2 K模式（2000×1332 px），设置系統以0.4°为间隔对样品进行180°持续扫描（如图1步骤B）。
2.3 CT图像重构
利用CT Scan NRecon（美国Bruker 公司，版本1.6.9.4）软件对CT扫描原始图像进行图像重构，获得一系列籽粒横截面格式为8-bit BMP的重构虚拟图像，分辨率为2000×2000 px（如图1步骤C）。
2.4 图像分割与表型指标计算
结合ScanIP图像处理软件对CT图像进行三维分割和表型指标计算，具体步骤如下。
（1）胚结构分割。胚部的分割主要根据图像中胚和胚乳部分灰度值的不同进行区分，采用区域生长（Region Growing）法进行图像分割。由于胚的灰度值与胚乳中的灰度值有重合，因此，在3D全序列切片上，胚乳部分会影响到胚的分割。采用单张2D序列图，选择性跳跃生长的操作可较好获得胚的轮廓。在本研究中选择20张图像进行区域生长，然后利用闭（close）操作实现胚的完整分割（如图1步骤D）。
（2）空腔结构分割。空腔位于籽粒内部，根据其分布位置不同，空腔可详细划分为胚空腔、胚乳空腔和皮下空腔。空腔部分与其它结构一方面灰度值差距明显，另一方面与其他结构独立不连通。根据其结构上独立不连通这一特性，使用Region growing在当前活动mode上操作，分割得到胚空腔的完整结构，胚乳空腔和皮下空腔分割过程同上。在获得胚空腔、胚乳空腔、皮下空腔完整结构后，将三者的mode相加得到总空腔的完整结构。
（3）胚乳结构分割。在空腔和胚结构都获得的情况下，直接利用完整籽粒的mode减去空腔和胚的部分即可得到胚乳部分（含种皮），之后利用腐蚀（erode）操作去除种皮部分。
（4）三维表型指标计算。通过以上步骤（1）～（3）可实现对玉米籽粒内部三维结构的分割，精细分割出胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔和胚空腔等不同的组织（如图1步骤E），进一步对各个成分进行计算即可获得相关表型指标，包括体积（Volume，mm3）、表面积 （Surface Area，mm2）、原始灰度均值（Mean Greyscale（Original））、体积比和比表面积等（如图1步骤F）。
2.5 数据分析
使用R语言自带的cor（ ）函数计算不同类型玉米籽粒表型指标间的相关系数，并利用corrplot包绘制相关性热图;采用单因素方差分析和灵敏度较高的最小显著差法（Least Significant Difference，LSD）在P<0.05水平比较不同类型玉米籽粒间的表型差异显著性;基于34项玉米籽粒显微表型指标，使用R语言cluster包pam（ ）函数进行K-中心点（K-Medoids）聚类分析。
3 结果与分析
3.1 玉米籽粒组织结构三维可视化及表型解析
基于CT序列图像，使用CT-分析器（CT-Analyser，CTAN）和CT-体积（CT-Volume，CTVOL）对获得的3D图像进行渲染，可实现样品内部结构的定性分析，确定其内部不同结构的特征，以及不同品种之间在内部结构上的差异。如图2所示，展示了不同类型不同品种籽粒结构的三视图：x-y平面（横轴视图），x-z平面（冠状视图）和z-y平面（旋转矢状视图）。结合ScanIP软件实现了对玉米籽粒内部三维结构的精细分割，包括胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔和胚空腔等6个不同的组织，进一步对各个成分进行计算，获得包括体积、表面积、原始灰度均值、体积比和比表面积等34项玉米籽粒显微表型指标，如表1所示。
3个维度的二维断面切片图像
3.2 籽粒表型性状相关性分析
为探究不同类型玉米籽粒表型指标之间的关系，对34项显微表型指标两两变量进行相关分析。结果发现，籽粒与胚乳在表面积、体积等表型指标上呈极显著正相关关系，相关系数r>0.94（图3），表明胚乳是构成籽粒的主要组成部分，符合胚乳约占玉米籽粒80%以上的结论;空腔、皮下空腔和胚乳空腔三者的体积和体积比两两之间相关系数r均大于0.8，呈极显著正相关，表明空腔大小主要受皮下空腔和胚乳空腔大小影响。
此外，本研究提取到一个能反应籽粒不同结构组织密度的指标Mean Greyscale（Original）。greyscale表示灰度，取值范围为0～255，0为黑色，255为白色[27]。其中致密物质为白色，空气为黑色[28]。籽粒不同组织结构原始灰度均值相关性分析显示，胚、胚乳和籽粒两两之间相关系数r均大于0.90，且灰度值相近，说明籽粒与胚乳、胚的组织密度相似，籽粒密度与其内部胚乳、胚组织显著相关。
3.3 籽粒表型性状差异分析 为探索同一表型指标在不同类型籽粒间的关系，利用R语言对表型指标进行单因素方差分析和LSD检验。本次试验单因素方差分析主要对籽粒整体、籽粒内部结构以及原始灰度均值进行分析。
3.3.1 籽粒整体组间差异分析
对11个品种玉米籽粒的体积大小进行排序发现，京92、B73、京724等普通玉米籽粒体积明显大于甜玉米京科甜608、高油玉米RY732、爆裂玉米105和830。其中普通玉米京92体积最大，为251.67 mm3，与特种玉米（糯玉米、爆裂玉米、高油玉米和甜玉米）具有显著差异（P<0.05）（表2）。但是普通玉米籽粒体积与糯玉米无法区分（表2），可能是由于糯玉米与普通玉米在籽粒大小外观表型相似的原因。
比表面积是指整个籽粒表面积与体积之比，也是衡量籽粒形态的重要指标。由表2可知，11个品种籽粒比表面积大小排序为京科甜608 > RY732 > 105 > 京科糯2016 > 京黄糯269 > 830 > 丹599 > B73> MC01 > 京724 > 京92，表明特種玉米籽粒比表面积普遍大于普通玉米籽粒比表面积。例如，比表面积最大为甜玉米京科甜608（2.59），与其他籽粒具有显著差异，而比表面积最小的特种玉米为830（1.49），其比表面积比普通玉米中比表面积最大的丹599（1.43）还大。
以上研究结果表明，基于籽粒体积和籽粒比表面积能实现对特种玉米和普通玉米籽粒的区分。
3.3.2 籽粒内部结构在不同类型籽粒间的差异分析
为进一步对比籽粒内部结构在不同类型籽粒间的差异，本研究对胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔以及胚空腔的表型指标进行单因素方差分析。如表3所示，在胚乳体积中排列前5的玉米籽粒中有4个为普通玉米，如京92、B73、京724和MC01，其中京92胚乳体积最大，为210.67 mm3。特种玉米中爆裂玉米105、高油玉米RY732和甜玉米京科甜608的胚乳体积明显小于普通玉米，其中京科甜608胚乳体积最小，为83.7 mm3。若按不同品种玉米籽粒胚乳空腔表面积由大到小进行排序，11个玉米籽粒中5个普通玉米排列在前七位，分别为丹599，京724，B73，MC01，京92，胚乳空腔表面积在88.73～132.40 mm2之间，显著高于其它类型玉米籽粒空腔表面积4.79～54.24 mm2（表4）。相反，若按胚体积比分类，除丹599，所有普通玉米籽粒胚体积比为9～15，普遍较小，明显小于其它类型玉米籽粒，如甜玉米京科甜608（胚体积比为25.19）以及高油玉米RY732（胚体积比为24.11）（表5）。以上分析表明，胚乳体积、胚乳空腔表面积以及胚体积比等显微表型指标可用于区分普通玉米和特种玉米（爆裂、高油及甜玉米等）。
由胚乳体积比差异分析结果可知，爆裂玉米105和830胚乳体积比值在所有玉米类型中排列前二，且比值均大于87（表5），表明爆裂类型玉米籽粒相较其它类型玉米籽粒胚乳体积占籽粒体积比较大。此外，根据差异分析结果发现，胚乳空腔比表面积表型指标可用于区分高油玉米RY732和甜玉米京科甜608。高油玉米RY732胚乳空腔比表面积最大，为97.44;相反甜玉米京科甜608胚乳空腔比表面积最小，为11.06，且与其他类型籽粒差异显著（表6）。通过差异分析还发现，胚乳空腔体积比大小也可用于高油玉米RY732和甜玉米京科甜608的区分。甜玉米京科甜608胚乳空腔体积比最大，为7.33，高油玉米RY732最小，为0.05，其中甜玉米京科甜608显著区别于其它类型玉米籽粒胚乳空腔体积比（表5）。
3.4 原始灰度均值的差异分析
本研究还对原始灰度均值进行差异分析。从表7可知，在11个品种玉米籽粒中，空腔组织结构胚空腔、胚乳空腔、皮下空腔原始灰度均值都低于50;非空腔组织结构胚、胚乳、籽粒原始灰度平均值均高于80，且籽粒空腔与非空腔灰度值差异显著。表明原始灰度均值能区分籽粒空腔与非空腔组织结构，可作为籽粒空腔与非空腔组织结构划分的重要表型指标。
3.5 表型指标聚类分析
使用R语言cluster包pam（ ）函数对34项显微表型指标进行K-Medoids聚类分析，结果如图4所示。图中不同颜色和形状划分的多边形代表不同的分类组，11种籽粒可被划分为四类。第一类：京724、MC01、京黄糯269、B73、丹599、京92（蓝色）;第二类：京科糯2016、105、830（绿色）;第三类：京科甜608（黄色）;第四类：RY732（红色）。
在分类的基础上，对四类籽粒做不同表型指标的单因素方差分析，结果如表8所示。其中，胚乳体积（Vend）、籽粒体积（Vk）、胚乳空腔表面积（Sendc）、胚空腔表面积（Sembc）、籽粒比表面积（SVk）、胚乳空腔比表面积（SVendc）、胚体积比（VVemb）和胚乳体积比（VVend）等8个表型指标在不同类型玉米籽粒中存在显著差异（P-value<0.05）。
为进一步确定上述存在显著差异的8个表型指标对不同分类组的影响程度，基于这8项表型指标和四类玉米籽粒类型进行LSD，结果表明，胚空腔表面积在4类玉米籽粒中不存在显著差异（表9），不适用于籽粒区分。因此，本研究使用除胚空腔表面积外的7个表型指标对不同类型玉米籽粒进行分类。
结合表型指标在不同分类组的均值大小，每一类的主要特征为：第一类籽粒胚乳空腔表面积、胚乳体积和籽粒体积最大，其中籽粒体积与其余三类籽粒体积具有显著差异;第二类籽粒胚乳体积比最大，但与第一类和第四类在P-value<0.05水平上无显著差异，胚体积比最小，但与第一类在P-value<0.05水平上无显著差异;第三类籽粒胚乳体积、胚乳空腔比表面积和胚乳体积比最小，籽粒比表面积和胚体积比最大;第四类籽粒胚乳空腔表面积和籽粒体积最小，胚乳空腔比表面积最大。 4 结论与讨论
本研究以普通玉米、糯玉米、爆裂玉米、高油玉米和甜玉米5种类型的11个品种玉米籽粒为研究对象，基于Micro-CT开展籽粒表型显微特征研究，主要结论有：
（1）利用CT扫描技术实现玉米籽粒、胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔和胚空腔等7个组织结构的三维分割及34项表型指标的精准提取。
（2）34项表型指标中，胚乳空腔表面积、籽粒体积、胚乳体积比和胚乳空腔比表面积等4项表型指标在不同类型玉米间差异显著（P-value<0.05）。其中，普通玉米胚乳空腔表面积和籽粒体积显著大于其他类型玉米籽粒，爆裂玉米胚乳体积比最大，高油玉米胚乳空腔比表面积最大，甜玉米胚乳空腔比表面积最小。
（3）基于34项表型指标进行差异分析和聚类分析，可将11个不同品种玉米籽粒分为四类。第一类：京724、MC01、京黄糯269、B73、丹599、京92;第二类： 105、830、京科糯2016;第三类：京科甜608;第四类：RY732。此分类结果与实际玉米类型基本吻合，表明Micro-CT扫描技术可以为不同品种玉米籽粒分类提供支持。
由于糯玉米同普通玉米相比较，两者主要区别在于内部组织生化成分不同，而在外形结构上无差异[29]，所以在进行表型数据聚类时，京黄糯269被划分在普通玉米中。在特种玉米中，甜玉米京科甜608胚乳空腔比表面积与其它类型玉米籽粒相比，其胚乳空腔比表面积最小，差异显著（表6）。相反，高油玉米籽粒RY732胚乳空腔比表面积在所有玉米籽粒中最大且差异显著（表6），说明胚乳空腔比表面积表型指标可用于区分甜玉米和高油玉米。该结果与聚类分析结果一致，高油玉米RY732 与甜玉米京科甜608被分别单独划分为一类（图4）。爆裂玉米105和830胚乳体积比值均大于其他类型玉米（表5），且聚类分析后存在显著差异的8个表型指标LSD检验发现，主要由爆裂玉米构成的第二类其胚乳体积比也大于其他三类（表9），表明胚乳体积比可作为爆裂玉米同其它类型玉米区分的重要依据。同样地，在区分普通玉米和特种玉米中，籽粒表型指标如籽粒体积、胚乳空腔表面积在种间差异较大，可用于区分普通玉米与特种玉米。例如，分别对胚乳空腔表面积、籽粒体积进行单因素方差分析，并对胚乳空腔表面积、籽粒体积大小排序。结果显示在11个籽粒中，排名前50%的玉米籽粒均為普通玉米（表4和表3），且该结果与聚类分析结果类似。在聚类分析中，普通玉米被划分为第一类，明显区分于其它三类特种玉米（图4）。差异分析结果和聚类分析结果均发现胚乳空腔表面积、籽粒体积、胚乳体积比和胚乳空腔比表面积这四项指标在不同类型玉米籽粒间存在显著差异，为不同类型玉米籽粒分类提供重要的参考依据。
现有的CT图像分割流程涉及大量的人工交互耗时长、效率低，无法满足高通量的玉米籽粒显微表型特征获取。今后，如何提升显微表型获取的效率与精度，开展大群体籽粒显微特征研究，将成为下一步工作的研究重点。
致 谢
感谢北京市农林科学院玉米中心段民孝副研究员和赵衍鑫副研究员提供部分玉米品种种子。
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Study on the Micro-Phenotype of Different Types of Maize Kernels Based on Micro-CT
ZHAO Huan1，2，3， WANG Jinglu1，2， LIAO Shengjin1，2， ZHANG Ying1，2， LU Xianju1，2， GUO Xinyu1，2， ZHAO Chunjiang1，2* （1.Beijing Research Center for Information Technology， Beijing 100097， China; 2.National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture/Beijing Key Lab of Digital Plant， Beijing 100097， China;
3.College of Plant Science & Technology of Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）
Abstract： Plant micro-phenotype mainly refers to the phenotypic information at the tissue， cell， and subcellular levels， which is an important part of plant phenomics research. In view of the problems of low efficiency， large error， and few traits of traditional methods for detecting kernel microscopic traits， Micro-CT scanning technology was used to carry out precise identification of micro-phenotype on 11 varieties of maize kernels. A total of 34 microscopic traits were obtained based on CT sequence images of 7 tissues， including seed， embryo， endosperm， cavity， subcutaneous cavity， endosperm cavity and embryo cavity. Among the 34 microscopic traits， 4 traits， including endosperm cavity surface area， kernel volume， endosperm volume ratio and endosperm cavity specific surface area， were significantly different among maize types （P-value<0.05）. The surface area of endosperm cavity and kernel volume of common maize were significantly higher than those of other types of maize. The specific surface area of endosperm cavity of high oil maize was the largest. The endosperm cavity of sweet corn had the smallest specific surface area. The endosperm volume ration of popcorn was the largest. Furthermore， 34 traits were used for One-way ANOVA and cluster analysis， and 11 different maize varieties were divided into four categories， of which the first category was mainly common maize， the second category was mainly popcorn， the third category was sweet corn， and the fourth category was high oil maize. The results indicated that Micro-CT scanning technology could not only achieve precise identification of micro-phenotype of maize kernels， but also provide supports for kernel classification and variety detection， and so on.
Key words： plant phenomics; micro-phenotype; Micro-CT; maize kernel; phenotype identification
关键词： 植物表型组学;显微表型;Micro-CT;玉米籽粒;表型鉴定
中图分类号： S126 文献标志码： A 文章编号： 202103-SA004
引用格式：赵欢， 王璟璐， 廖生进， 张颖， 卢宪菊， 郭新宇， 赵春江. 基于Micro-CT的玉米籽粒显微表型特征研究[J]. 智慧农业（中英文）， 2021， 3 （1）： 16-28.
Citation：ZHAO Huan， WANG Jinglu， LIAO Shengjin， ZHANG Ying， LU Xianju， GUO Xinyu， ZHAO Chunjiang. Study on the micro-phenotype of different types of maize kernels based on Micro-CT[J]. Smart Agriculture， 2021， 3 （1）： 16-28. （
1 引 言
进入21世纪以来，随着新一代信息技术迅速发展，大数据时代及育种4.0[1]的到来，使得农业科学从传统的理论科学、实验科学和计算科学转向数据密集型知识发现研究的科学发展阶段，推动作物科学进入以大數据为核心的组学研究时代[2]。进入组学研究时代的农业基础研究，迫切需要借助先进的信息化手段和自动化、高通量的表型获取与解析平台，打破传统作物表型鉴定和分析技术的限制，从组学研究高度深入挖掘“表型—基因型—环境型”内在关系研究[2]，从而更好地为植物功能基因组学和作物分子育种研究服务[3]。
植物表型已在作物育种[4]、分子生物学[5]和微生物学[6]等多个领域中得到广泛应用。Tardieu等[7]将植物表型定义为反映植物结构和组成的，或反映植物生长发育过程和结果的受基因型和环境互作产生的全部或部分可辨识特征和性状。赵春江[2]对植物表型进行更为系统、全面的总结，即植物表型是指能够反映植物细胞、组织、器官、植株和群体结构及功能的物理、生理和生化性状。植物表型涉及范围广，小到核苷酸序列，大到植株群体[8-10]，都属于植物表型的研究范畴。
显微表型是植物表型的重要组成部分，是指在植物组织、细胞和亚细胞层面上能反映植株内部和生化的特征和性状[2]，在特异基因精准鉴定和功能预测上能够发挥重要作用。但相对于器官、植株和群体水平的表型信息获取与解析，显微表型相关工作相对较少、发展相对滞后。如何全面、快速获得植物基于组织细胞的表型信息，是植物表型组学的重要研究内容。针对传统显微表型研究存在的问题，构建现代显微表型研究技术是满足当前植物表型组学尤其是显微表型精准鉴定的关键。
以X射线扫描技术等为代表的新的成像技术极大促进了植物表型组学和植物发育生物学的发展。X射线电子计算机断层扫描——Micro-CT，是一种三维断层扫描成像技术，根据植物不同组织对X射线吸收和透过率的差异，重建获得植物组织的断面或立体图像[11]。Micro-CT最初应用于医学研究，后因为其具有非侵入性、非破坏性和高分辨率等特点，近几年被逐渐引用到农业领域中并得到高度关注。在玉米研究中，基于Micro-CT扫描技术可以从显微水平对玉米表型进行鉴定和功能研究，如提取玉米根系导管三维信息研究其与植物抗旱性的关系[12]，获取茎秆维管束信息研究其与抗倒伏性的关系[13，14]等。将CT图像与图像自动处理软件相结合，可实现玉米显微表型数据的高通量获取和解析，进而与基因组数据相结合进行关联分析，挖掘显微表型相关的候选基因[11]，实现多组学间的交叉融合。
玉米籽粒作为决定玉米产量的重要“库”，内部含有淀粉、蛋白质、脂肪、水溶性多糖、维生素、矿物质以及人体必需的氨基酸等多种生理活性物质[15]。根据玉米植物学特征和生物学特性，可将玉米籽粒划分为多种类型。如根据特殊用途和利用价值，玉米籽粒可被划分为普通玉米和特种玉米，其中特种玉米包含甜玉米、糯玉米、高油玉米和爆裂玉米等多种类型[16-19]。玉米籽粒主要由胚、胚乳和种皮构成，近几年研究还发现了玉米籽粒空腔的存在。根据其分布位置不同，空腔又被详细划分胚空腔、胚乳空腔和皮下空腔[20]。传统玉米籽粒表型获取分析方法主要分为两大类，一是利用考种仪获取玉米籽粒的常规RGB图像并对其进行分析，能得到籽粒的长度、宽度、厚度和密度等外部形态特征表型参数，以及籽粒颜色纹理特征[21]。同Micro-CT相比，获得样品颜色纹理特征是常规RGB图像具备的显著优势，但其也具有不可忽略的局限性，即基于考种RGB图像无法提供籽粒内部形态特征，实现籽粒内部结构研究。二是制作籽粒石蜡切片，在光学显微镜下观察籽粒形态结构并拍摄图像，利用相关算法将多个切片图像进行叠加从而取得整个籽粒的表型特征。虽然采用“切片+显微镜”观察能获得籽粒内部形态结构特征，但是切片制备过程复杂，会出现人工和机械误差，使得获取的序列图像出现如位置偏移等诸多问题，进而导致基于切片图像的三维重构和可视化效果较差[22]。此外，籽粒切片处理后，籽粒完整性受到严重破坏，无法用于后续研究。基于X射线断层扫描技术的植物作物学组织研究方法克服了传统制片的复杂过程，实现了无损、三维的组织成像结果及三维表型的定量分析。Rousseau等[23]首次采用同步辐射X射线同轴成像显微技术研究玉米籽粒的三维解剖结构，并通过调节图像阈值和主动轮廓算法（Active Contour Method）进行籽粒种皮、珠心、胚乳和胚等结构的分割，验证了X射线断层扫描技术能够快速获取植物组织的空间结构和分割组织内部不同的结构信息;Guelpa等[24，25]利用uCT扫描估计粉质胚乳和硬质胚乳的真实密度以及整颗籽粒的密度，结合空腔比值和孔隙率实现了玉米籽粒硬度分类和品质分级;Shao等[26]基于Micro-CT获取的玉米籽粒三维图像发现玉米籽粒密度、孔隙度等表型特征与种子饱满度分级密切相关。但是目前关于利用Micro-CT对不同类型玉米籽粒显微表型特征进行研究的报道尚不多见。 本研究以常见5种类型的11个品种玉米籽粒作为研究对象，研究基于Micro-CT的玉米籽粒显微表型精准鉴定方法，探究不同类型籽粒显微性状特征差异，以期为籽粒分类、品质检测提供依据。
2 试验材料与方法
2.1 试验材料
选取常见5种类型的11个品种玉米籽粒作为研究对象，分别为普通玉米：B73，丹599，京92，京724，MC01;爆裂玉米：830和105;糯玉米：京黄糯269和京科糯2016;甜玉米：京科甜608;高油玉米：RY732。每个品种选取3颗生长发育一致的籽粒用于后续CT扫描。
2.2 籽粒CT扫描
利用X-射线显微CT系统（美国Bruker公司，SkyScan 1172型）对玉米籽粒进行CT扫描。扫描电压为40 kV，电流为250 uA，扫描像素间隔设置为13.55 um，样品距光源和相机距光源的距离分别为259.850 mm和345.591 mm，扫描模式为2 K模式（2000×1332 px），设置系統以0.4°为间隔对样品进行180°持续扫描（如图1步骤B）。
2.3 CT图像重构
利用CT Scan NRecon（美国Bruker 公司，版本1.6.9.4）软件对CT扫描原始图像进行图像重构，获得一系列籽粒横截面格式为8-bit BMP的重构虚拟图像，分辨率为2000×2000 px（如图1步骤C）。
2.4 图像分割与表型指标计算
结合ScanIP图像处理软件对CT图像进行三维分割和表型指标计算，具体步骤如下。
（1）胚结构分割。胚部的分割主要根据图像中胚和胚乳部分灰度值的不同进行区分，采用区域生长（Region Growing）法进行图像分割。由于胚的灰度值与胚乳中的灰度值有重合，因此，在3D全序列切片上，胚乳部分会影响到胚的分割。采用单张2D序列图，选择性跳跃生长的操作可较好获得胚的轮廓。在本研究中选择20张图像进行区域生长，然后利用闭（close）操作实现胚的完整分割（如图1步骤D）。
（2）空腔结构分割。空腔位于籽粒内部，根据其分布位置不同，空腔可详细划分为胚空腔、胚乳空腔和皮下空腔。空腔部分与其它结构一方面灰度值差距明显，另一方面与其他结构独立不连通。根据其结构上独立不连通这一特性，使用Region growing在当前活动mode上操作，分割得到胚空腔的完整结构，胚乳空腔和皮下空腔分割过程同上。在获得胚空腔、胚乳空腔、皮下空腔完整结构后，将三者的mode相加得到总空腔的完整结构。
（3）胚乳结构分割。在空腔和胚结构都获得的情况下，直接利用完整籽粒的mode减去空腔和胚的部分即可得到胚乳部分（含种皮），之后利用腐蚀（erode）操作去除种皮部分。
（4）三维表型指标计算。通过以上步骤（1）～（3）可实现对玉米籽粒内部三维结构的分割，精细分割出胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔和胚空腔等不同的组织（如图1步骤E），进一步对各个成分进行计算即可获得相关表型指标，包括体积（Volume，mm3）、表面积 （Surface Area，mm2）、原始灰度均值（Mean Greyscale（Original））、体积比和比表面积等（如图1步骤F）。
2.5 数据分析
使用R语言自带的cor（ ）函数计算不同类型玉米籽粒表型指标间的相关系数，并利用corrplot包绘制相关性热图;采用单因素方差分析和灵敏度较高的最小显著差法（Least Significant Difference，LSD）在P<0.05水平比较不同类型玉米籽粒间的表型差异显著性;基于34项玉米籽粒显微表型指标，使用R语言cluster包pam（ ）函数进行K-中心点（K-Medoids）聚类分析。
3 结果与分析
3.1 玉米籽粒组织结构三维可视化及表型解析
基于CT序列图像，使用CT-分析器（CT-Analyser，CTAN）和CT-体积（CT-Volume，CTVOL）对获得的3D图像进行渲染，可实现样品内部结构的定性分析，确定其内部不同结构的特征，以及不同品种之间在内部结构上的差异。如图2所示，展示了不同类型不同品种籽粒结构的三视图：x-y平面（横轴视图），x-z平面（冠状视图）和z-y平面（旋转矢状视图）。结合ScanIP软件实现了对玉米籽粒内部三维结构的精细分割，包括胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔和胚空腔等6个不同的组织，进一步对各个成分进行计算，获得包括体积、表面积、原始灰度均值、体积比和比表面积等34项玉米籽粒显微表型指标，如表1所示。
3个维度的二维断面切片图像
3.2 籽粒表型性状相关性分析
为探究不同类型玉米籽粒表型指标之间的关系，对34项显微表型指标两两变量进行相关分析。结果发现，籽粒与胚乳在表面积、体积等表型指标上呈极显著正相关关系，相关系数r>0.94（图3），表明胚乳是构成籽粒的主要组成部分，符合胚乳约占玉米籽粒80%以上的结论;空腔、皮下空腔和胚乳空腔三者的体积和体积比两两之间相关系数r均大于0.8，呈极显著正相关，表明空腔大小主要受皮下空腔和胚乳空腔大小影响。
此外，本研究提取到一个能反应籽粒不同结构组织密度的指标Mean Greyscale（Original）。greyscale表示灰度，取值范围为0～255，0为黑色，255为白色[27]。其中致密物质为白色，空气为黑色[28]。籽粒不同组织结构原始灰度均值相关性分析显示，胚、胚乳和籽粒两两之间相关系数r均大于0.90，且灰度值相近，说明籽粒与胚乳、胚的组织密度相似，籽粒密度与其内部胚乳、胚组织显著相关。
3.3 籽粒表型性状差异分析 为探索同一表型指标在不同类型籽粒间的关系，利用R语言对表型指标进行单因素方差分析和LSD检验。本次试验单因素方差分析主要对籽粒整体、籽粒内部结构以及原始灰度均值进行分析。
3.3.1 籽粒整体组间差异分析
对11个品种玉米籽粒的体积大小进行排序发现，京92、B73、京724等普通玉米籽粒体积明显大于甜玉米京科甜608、高油玉米RY732、爆裂玉米105和830。其中普通玉米京92体积最大，为251.67 mm3，与特种玉米（糯玉米、爆裂玉米、高油玉米和甜玉米）具有显著差异（P<0.05）（表2）。但是普通玉米籽粒体积与糯玉米无法区分（表2），可能是由于糯玉米与普通玉米在籽粒大小外观表型相似的原因。
比表面积是指整个籽粒表面积与体积之比，也是衡量籽粒形态的重要指标。由表2可知，11个品种籽粒比表面积大小排序为京科甜608 > RY732 > 105 > 京科糯2016 > 京黄糯269 > 830 > 丹599 > B73> MC01 > 京724 > 京92，表明特種玉米籽粒比表面积普遍大于普通玉米籽粒比表面积。例如，比表面积最大为甜玉米京科甜608（2.59），与其他籽粒具有显著差异，而比表面积最小的特种玉米为830（1.49），其比表面积比普通玉米中比表面积最大的丹599（1.43）还大。
以上研究结果表明，基于籽粒体积和籽粒比表面积能实现对特种玉米和普通玉米籽粒的区分。
3.3.2 籽粒内部结构在不同类型籽粒间的差异分析
为进一步对比籽粒内部结构在不同类型籽粒间的差异，本研究对胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔以及胚空腔的表型指标进行单因素方差分析。如表3所示，在胚乳体积中排列前5的玉米籽粒中有4个为普通玉米，如京92、B73、京724和MC01，其中京92胚乳体积最大，为210.67 mm3。特种玉米中爆裂玉米105、高油玉米RY732和甜玉米京科甜608的胚乳体积明显小于普通玉米，其中京科甜608胚乳体积最小，为83.7 mm3。若按不同品种玉米籽粒胚乳空腔表面积由大到小进行排序，11个玉米籽粒中5个普通玉米排列在前七位，分别为丹599，京724，B73，MC01，京92，胚乳空腔表面积在88.73～132.40 mm2之间，显著高于其它类型玉米籽粒空腔表面积4.79～54.24 mm2（表4）。相反，若按胚体积比分类，除丹599，所有普通玉米籽粒胚体积比为9～15，普遍较小，明显小于其它类型玉米籽粒，如甜玉米京科甜608（胚体积比为25.19）以及高油玉米RY732（胚体积比为24.11）（表5）。以上分析表明，胚乳体积、胚乳空腔表面积以及胚体积比等显微表型指标可用于区分普通玉米和特种玉米（爆裂、高油及甜玉米等）。
由胚乳体积比差异分析结果可知，爆裂玉米105和830胚乳体积比值在所有玉米类型中排列前二，且比值均大于87（表5），表明爆裂类型玉米籽粒相较其它类型玉米籽粒胚乳体积占籽粒体积比较大。此外，根据差异分析结果发现，胚乳空腔比表面积表型指标可用于区分高油玉米RY732和甜玉米京科甜608。高油玉米RY732胚乳空腔比表面积最大，为97.44;相反甜玉米京科甜608胚乳空腔比表面积最小，为11.06，且与其他类型籽粒差异显著（表6）。通过差异分析还发现，胚乳空腔体积比大小也可用于高油玉米RY732和甜玉米京科甜608的区分。甜玉米京科甜608胚乳空腔体积比最大，为7.33，高油玉米RY732最小，为0.05，其中甜玉米京科甜608显著区别于其它类型玉米籽粒胚乳空腔体积比（表5）。
3.4 原始灰度均值的差异分析
本研究还对原始灰度均值进行差异分析。从表7可知，在11个品种玉米籽粒中，空腔组织结构胚空腔、胚乳空腔、皮下空腔原始灰度均值都低于50;非空腔组织结构胚、胚乳、籽粒原始灰度平均值均高于80，且籽粒空腔与非空腔灰度值差异显著。表明原始灰度均值能区分籽粒空腔与非空腔组织结构，可作为籽粒空腔与非空腔组织结构划分的重要表型指标。
3.5 表型指标聚类分析
使用R语言cluster包pam（ ）函数对34项显微表型指标进行K-Medoids聚类分析，结果如图4所示。图中不同颜色和形状划分的多边形代表不同的分类组，11种籽粒可被划分为四类。第一类：京724、MC01、京黄糯269、B73、丹599、京92（蓝色）;第二类：京科糯2016、105、830（绿色）;第三类：京科甜608（黄色）;第四类：RY732（红色）。
在分类的基础上，对四类籽粒做不同表型指标的单因素方差分析，结果如表8所示。其中，胚乳体积（Vend）、籽粒体积（Vk）、胚乳空腔表面积（Sendc）、胚空腔表面积（Sembc）、籽粒比表面积（SVk）、胚乳空腔比表面积（SVendc）、胚体积比（VVemb）和胚乳体积比（VVend）等8个表型指标在不同类型玉米籽粒中存在显著差异（P-value<0.05）。
为进一步确定上述存在显著差异的8个表型指标对不同分类组的影响程度，基于这8项表型指标和四类玉米籽粒类型进行LSD，结果表明，胚空腔表面积在4类玉米籽粒中不存在显著差异（表9），不适用于籽粒区分。因此，本研究使用除胚空腔表面积外的7个表型指标对不同类型玉米籽粒进行分类。
结合表型指标在不同分类组的均值大小，每一类的主要特征为：第一类籽粒胚乳空腔表面积、胚乳体积和籽粒体积最大，其中籽粒体积与其余三类籽粒体积具有显著差异;第二类籽粒胚乳体积比最大，但与第一类和第四类在P-value<0.05水平上无显著差异，胚体积比最小，但与第一类在P-value<0.05水平上无显著差异;第三类籽粒胚乳体积、胚乳空腔比表面积和胚乳体积比最小，籽粒比表面积和胚体积比最大;第四类籽粒胚乳空腔表面积和籽粒体积最小，胚乳空腔比表面积最大。 4 结论与讨论
本研究以普通玉米、糯玉米、爆裂玉米、高油玉米和甜玉米5种类型的11个品种玉米籽粒为研究对象，基于Micro-CT开展籽粒表型显微特征研究，主要结论有：
（1）利用CT扫描技术实现玉米籽粒、胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔和胚空腔等7个组织结构的三维分割及34项表型指标的精准提取。
（2）34项表型指标中，胚乳空腔表面积、籽粒体积、胚乳体积比和胚乳空腔比表面积等4项表型指标在不同类型玉米间差异显著（P-value<0.05）。其中，普通玉米胚乳空腔表面积和籽粒体积显著大于其他类型玉米籽粒，爆裂玉米胚乳体积比最大，高油玉米胚乳空腔比表面积最大，甜玉米胚乳空腔比表面积最小。
（3）基于34项表型指标进行差异分析和聚类分析，可将11个不同品种玉米籽粒分为四类。第一类：京724、MC01、京黄糯269、B73、丹599、京92;第二类： 105、830、京科糯2016;第三类：京科甜608;第四类：RY732。此分类结果与实际玉米类型基本吻合，表明Micro-CT扫描技术可以为不同品种玉米籽粒分类提供支持。
由于糯玉米同普通玉米相比较，两者主要区别在于内部组织生化成分不同，而在外形结构上无差异[29]，所以在进行表型数据聚类时，京黄糯269被划分在普通玉米中。在特种玉米中，甜玉米京科甜608胚乳空腔比表面积与其它类型玉米籽粒相比，其胚乳空腔比表面积最小，差异显著（表6）。相反，高油玉米籽粒RY732胚乳空腔比表面积在所有玉米籽粒中最大且差异显著（表6），说明胚乳空腔比表面积表型指标可用于区分甜玉米和高油玉米。该结果与聚类分析结果一致，高油玉米RY732 与甜玉米京科甜608被分别单独划分为一类（图4）。爆裂玉米105和830胚乳体积比值均大于其他类型玉米（表5），且聚类分析后存在显著差异的8个表型指标LSD检验发现，主要由爆裂玉米构成的第二类其胚乳体积比也大于其他三类（表9），表明胚乳体积比可作为爆裂玉米同其它类型玉米区分的重要依据。同样地，在区分普通玉米和特种玉米中，籽粒表型指标如籽粒体积、胚乳空腔表面积在种间差异较大，可用于区分普通玉米与特种玉米。例如，分别对胚乳空腔表面积、籽粒体积进行单因素方差分析，并对胚乳空腔表面积、籽粒体积大小排序。结果显示在11个籽粒中，排名前50%的玉米籽粒均為普通玉米（表4和表3），且该结果与聚类分析结果类似。在聚类分析中，普通玉米被划分为第一类，明显区分于其它三类特种玉米（图4）。差异分析结果和聚类分析结果均发现胚乳空腔表面积、籽粒体积、胚乳体积比和胚乳空腔比表面积这四项指标在不同类型玉米籽粒间存在显著差异，为不同类型玉米籽粒分类提供重要的参考依据。
现有的CT图像分割流程涉及大量的人工交互耗时长、效率低，无法满足高通量的玉米籽粒显微表型特征获取。今后，如何提升显微表型获取的效率与精度，开展大群体籽粒显微特征研究，将成为下一步工作的研究重点。
致 谢
感谢北京市农林科学院玉米中心段民孝副研究员和赵衍鑫副研究员提供部分玉米品种种子。
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Study on the Micro-Phenotype of Different Types of Maize Kernels Based on Micro-CT
ZHAO Huan1，2，3， WANG Jinglu1，2， LIAO Shengjin1，2， ZHANG Ying1，2， LU Xianju1，2， GUO Xinyu1，2， ZHAO Chunjiang1，2* （1.Beijing Research Center for Information Technology， Beijing 100097， China; 2.National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture/Beijing Key Lab of Digital Plant， Beijing 100097， China;
3.College of Plant Science & Technology of Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）
Abstract： Plant micro-phenotype mainly refers to the phenotypic information at the tissue， cell， and subcellular levels， which is an important part of plant phenomics research. In view of the problems of low efficiency， large error， and few traits of traditional methods for detecting kernel microscopic traits， Micro-CT scanning technology was used to carry out precise identification of micro-phenotype on 11 varieties of maize kernels. A total of 34 microscopic traits were obtained based on CT sequence images of 7 tissues， including seed， embryo， endosperm， cavity， subcutaneous cavity， endosperm cavity and embryo cavity. Among the 34 microscopic traits， 4 traits， including endosperm cavity surface area， kernel volume， endosperm volume ratio and endosperm cavity specific surface area， were significantly different among maize types （P-value<0.05）. The surface area of endosperm cavity and kernel volume of common maize were significantly higher than those of other types of maize. The specific surface area of endosperm cavity of high oil maize was the largest. The endosperm cavity of sweet corn had the smallest specific surface area. The endosperm volume ration of popcorn was the largest. Furthermore， 34 traits were used for One-way ANOVA and cluster analysis， and 11 different maize varieties were divided into four categories， of which the first category was mainly common maize， the second category was mainly popcorn， the third category was sweet corn， and the fourth category was high oil maize. The results indicated that Micro-CT scanning technology could not only achieve precise identification of micro-phenotype of maize kernels， but also provide supports for kernel classification and variety detection， and so on.
Key words： plant phenomics; micro-phenotype; Micro-CT; maize kernel; phenotype identification