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摘 要目的:探讨用新的纯化试剂淋巴细胞分离液进行成年杂种猪的胰岛分离、纯化的研究,获得高纯度的胰岛细胞。方法:成年杂种猪,体重100～200 kg,采用胰管逆流灌注V型胶原酶,38.5℃水浴内外消化相结合,用淋巴细胞分离液离心法对胰岛细胞进行纯化,并对获得的胰岛细胞DTZ染色计数、计算当量。结果:消化时间为约30 min,胰岛数量为8548±1408个/g;纯化后胰岛收获量为:胰岛数7886±1697个/g,纯度>95%。结论:采用淋巴细胞分离液离心,可以缩短成年猪胰岛分离纯化时间,提高胰岛纯度。方法可降低实验成本,同时可获得高质量的胰岛细胞团。
关键词成年猪;胰岛;分离;纯化
中图分类号R5文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)101-0111-01
胰岛移植已日渐成为I型糖尿病及II型糖尿病终末期治疗的最理想方法,但在临床应用中依然存在供体来源缺乏、免疫排斥等问题。猪胰岛素与人类胰岛素最接近,而且来源广泛,因此将猪的胰岛移植至糖尿病患者也是移植研究的一个热门方向。
文献报道成年猪和胎猪等的胰岛分离、纯化较多,但是均存在胰岛纯度不高,试剂配制比例不统一、操作复杂等问题;本研究将采用一种淋巴细胞分离液进行成年猪胰岛的分离纯化,得到了纯度和量均较高的胰岛,为进一步胰岛移植研究打下基础。
1动物、试剂与器材
1)动物:成年杂种猪,雌雄不限;猪龄6～7月,体重100～200kg,温州篮子集团禽畜屠宰场提供。
2)试剂:胶原酶V sigma公司;双硫腙(DTZ)上海试剂三厂;Ficoll-PaqueTM PLUS(GE Healthcare Ltd.);HEPES(ShangHai Mdmy Science﹠Technologies.Ltd.);青-链霉素溶液(100x)、RPMI1640(吉诺生物医药技术有限公司);DNA酶(包头生物制剂公司),Euro-collins 液、Hanks液、D-Hanks液实验室自制。
3)实验器材:立式电热压力蒸汽灭菌器:LDZX-30KA,上海申安医疗器械厂;电热恒温振荡水槽:DKZ-450B,上海森信实验仪器有限公司;倒置显微镜:XDS-1B,OLYMPUS;荧光显微镜:OLYMPUS;光学显微镜:YS100,Nikon;洁净工作台:HDL Apparatus;低温离心机和二氧化碳培养箱:Thermo Electron Corporation。
2实验方法
1)猪胰腺的灌注、分离和消化成年猪屠宰后在相对无菌的条件下取出胰岛含量丰富的猪胰腺脾叶(体尾部),保存在冷Euro-collins液(4℃)中尽快送到实验室。整个过程中温缺血时间为15～20min,冷缺血时间为40～50min。
胰腺取回后,快速去除胰周脂肪、血管及胰腺被膜,从胰头和胰尾中间横断,暴露胰管,用天平称重。从胰管中插入22G套管针,并注入由D-Hanks液配制的胶原酶溶液(浓度为1.5mg/ml,含Ca2+7.5mmol/l,含DNA酶0.3mg/ml,4℃,HEPES10mmol/l),容积约为胰腺重量的2倍,注射速度7ml/min,先快后慢,3~4min内完成,置150ml具塞锥形瓶,同时放入3个1cm的玻璃球,在38.5℃水浴中静止消化约30min,消化过程中消化液的pH值尽量维持在7.0左右。当胰腺组织消化呈松散状时,将胰腺组织放入含10%小牛血清的冷Hanks液中终止消化,轻轻振荡后用800μm的滤网过滤;未消化的胰腺组织重新置Hanks中38.5℃水浴,并加入玻璃小球,振荡消化约10min,再用800μm的滤网过滤回收。收集的消化组织用含抗生素及10%小牛血清的RPMI1640培养基1200rpm离心1次,5min,至15ml离心管中,加含抗生素及10%小牛血清的RPMI1640培养基1200rpm离心5min,倒干上清。
2)胰岛纯化在上述含消化组织沉淀的15ml离心管中加入密度为1.077g/cm3的Ficoll-PaqueTMPLUS液5ml混匀,上面小心加入冷的Hanks液3ml,在2000rpm的条件下离心10min,离心后在Ficoll液和Hanks液之间收集纯化胰岛。在4℃用含10%胎牛血清的RPMI1640,1000rpm离心5min洗涤,重复洗涤1次。
3)胰岛计数:消化组织悬浮液用双硫腙(DTZ)溶液进行染色后,在显微镜下计数直径50μm以上的胰岛。重复取样3次,计数并求出平均值,算出每克胰腺组织分离的胰岛数量及胰岛当量IEQ。
4)胰岛纯度测定:纯化后的胰岛计数时,用显微镜下胰腺组织总面积中胰岛的面积所占的比例定为纯度。
5)统计学处理数据采用均数Ā±s表示,使用SPSS11.0軟件分析处理。
3结果
1)灌注充分的胰腺外观呈葡萄状;采用新的纯化液纯化,得到的胰岛量很多,而且纯度非常高(如图1)。
灌注充分的猪胰尾纯化后的胰岛(*40)
图1成年猪胰腺的灌注和胰岛分离纯化结果
2)胰岛纯化前后的数量和当量结果如下:
纯化前胰岛收获量为:胰岛数/g胰腺8548±1408(IEQ:5323±3269
个/g);
纯化后胰岛收获量为:胰岛数/g胰腺7886±1697,(IEQ:4987±2278个/g)。
3)所得胰岛纯度很高,为95%以上。
4讨论
本实验采用Ficoll-PaqueTMPLUS淋巴细胞分离液作为胰岛纯化液,内毒素含量低,密度为1.077,而胰岛细胞团密度约1.070,而胰腺外分泌组织的密度较大,因此将此分离液与胰腺消化组织液混悬、离心后,胰岛即悬浮于纯化液与Hank’s液的交界层。该纯化方法不仅操作简便,避免了自行配制Ficoll400液时密度难以掌握,需灭菌操作等繁杂操作,而且实验结果显示,采用Ficoll-PaqueTMPLUS作为纯化液,实验重现性好,得到的胰岛产量大、纯度高。且操作简便,为下一步胰岛的培养、微囊化和移植赢得了时间。
基金项目:国家自然科学基金81071277;浙江省自然科学基金项目:Y2080915;大学生科技创新项目
参考文献
[1]黄跃南,郭欣,吴德全,等.胰岛细胞移植的研究进展[J].肝胆胰外科杂志,2004,16(3):72-75.
[2]BuglianiM,LupiR,Del Guerra S,et al.An alternative and simple method
to consistently prepare viable isolated human islets for clin:caltransplantation.Transplant Proc2004;36:605-606.
[3]LembertN,WescheJ,PetersenP,etal.A real density measurement is a convenient
method for the determination of porcine islet equivalent without counting and sizing individual islets[J].CellTransplantation,2003(12):33-41.
作者简介
傅红兴(1979—),男,讲师,长期从事微囊化胰岛移植研究。
关键词成年猪;胰岛;分离;纯化
中图分类号R5文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)101-0111-01
胰岛移植已日渐成为I型糖尿病及II型糖尿病终末期治疗的最理想方法,但在临床应用中依然存在供体来源缺乏、免疫排斥等问题。猪胰岛素与人类胰岛素最接近,而且来源广泛,因此将猪的胰岛移植至糖尿病患者也是移植研究的一个热门方向。
文献报道成年猪和胎猪等的胰岛分离、纯化较多,但是均存在胰岛纯度不高,试剂配制比例不统一、操作复杂等问题;本研究将采用一种淋巴细胞分离液进行成年猪胰岛的分离纯化,得到了纯度和量均较高的胰岛,为进一步胰岛移植研究打下基础。
1动物、试剂与器材
1)动物:成年杂种猪,雌雄不限;猪龄6～7月,体重100～200kg,温州篮子集团禽畜屠宰场提供。
2)试剂:胶原酶V sigma公司;双硫腙(DTZ)上海试剂三厂;Ficoll-PaqueTM PLUS(GE Healthcare Ltd.);HEPES(ShangHai Mdmy Science﹠Technologies.Ltd.);青-链霉素溶液(100x)、RPMI1640(吉诺生物医药技术有限公司);DNA酶(包头生物制剂公司),Euro-collins 液、Hanks液、D-Hanks液实验室自制。
3)实验器材:立式电热压力蒸汽灭菌器:LDZX-30KA,上海申安医疗器械厂;电热恒温振荡水槽:DKZ-450B,上海森信实验仪器有限公司;倒置显微镜:XDS-1B,OLYMPUS;荧光显微镜:OLYMPUS;光学显微镜:YS100,Nikon;洁净工作台:HDL Apparatus;低温离心机和二氧化碳培养箱:Thermo Electron Corporation。
2实验方法
1)猪胰腺的灌注、分离和消化成年猪屠宰后在相对无菌的条件下取出胰岛含量丰富的猪胰腺脾叶(体尾部),保存在冷Euro-collins液(4℃)中尽快送到实验室。整个过程中温缺血时间为15～20min,冷缺血时间为40～50min。
胰腺取回后,快速去除胰周脂肪、血管及胰腺被膜,从胰头和胰尾中间横断,暴露胰管,用天平称重。从胰管中插入22G套管针,并注入由D-Hanks液配制的胶原酶溶液(浓度为1.5mg/ml,含Ca2+7.5mmol/l,含DNA酶0.3mg/ml,4℃,HEPES10mmol/l),容积约为胰腺重量的2倍,注射速度7ml/min,先快后慢,3~4min内完成,置150ml具塞锥形瓶,同时放入3个1cm的玻璃球,在38.5℃水浴中静止消化约30min,消化过程中消化液的pH值尽量维持在7.0左右。当胰腺组织消化呈松散状时,将胰腺组织放入含10%小牛血清的冷Hanks液中终止消化,轻轻振荡后用800μm的滤网过滤;未消化的胰腺组织重新置Hanks中38.5℃水浴,并加入玻璃小球,振荡消化约10min,再用800μm的滤网过滤回收。收集的消化组织用含抗生素及10%小牛血清的RPMI1640培养基1200rpm离心1次,5min,至15ml离心管中,加含抗生素及10%小牛血清的RPMI1640培养基1200rpm离心5min,倒干上清。
2)胰岛纯化在上述含消化组织沉淀的15ml离心管中加入密度为1.077g/cm3的Ficoll-PaqueTMPLUS液5ml混匀,上面小心加入冷的Hanks液3ml,在2000rpm的条件下离心10min,离心后在Ficoll液和Hanks液之间收集纯化胰岛。在4℃用含10%胎牛血清的RPMI1640,1000rpm离心5min洗涤,重复洗涤1次。
3)胰岛计数:消化组织悬浮液用双硫腙(DTZ)溶液进行染色后,在显微镜下计数直径50μm以上的胰岛。重复取样3次,计数并求出平均值,算出每克胰腺组织分离的胰岛数量及胰岛当量IEQ。
4)胰岛纯度测定:纯化后的胰岛计数时,用显微镜下胰腺组织总面积中胰岛的面积所占的比例定为纯度。
5)统计学处理数据采用均数Ā±s表示,使用SPSS11.0軟件分析处理。
3结果
1)灌注充分的胰腺外观呈葡萄状;采用新的纯化液纯化,得到的胰岛量很多,而且纯度非常高(如图1)。
灌注充分的猪胰尾纯化后的胰岛(*40)
图1成年猪胰腺的灌注和胰岛分离纯化结果
2)胰岛纯化前后的数量和当量结果如下:
纯化前胰岛收获量为:胰岛数/g胰腺8548±1408(IEQ:5323±3269
个/g);
纯化后胰岛收获量为:胰岛数/g胰腺7886±1697,(IEQ:4987±2278个/g)。
3)所得胰岛纯度很高,为95%以上。
4讨论
本实验采用Ficoll-PaqueTMPLUS淋巴细胞分离液作为胰岛纯化液,内毒素含量低,密度为1.077,而胰岛细胞团密度约1.070,而胰腺外分泌组织的密度较大,因此将此分离液与胰腺消化组织液混悬、离心后,胰岛即悬浮于纯化液与Hank’s液的交界层。该纯化方法不仅操作简便,避免了自行配制Ficoll400液时密度难以掌握,需灭菌操作等繁杂操作,而且实验结果显示,采用Ficoll-PaqueTMPLUS作为纯化液,实验重现性好,得到的胰岛产量大、纯度高。且操作简便,为下一步胰岛的培养、微囊化和移植赢得了时间。
基金项目:国家自然科学基金81071277;浙江省自然科学基金项目:Y2080915;大学生科技创新项目
参考文献
[1]黄跃南,郭欣,吴德全,等.胰岛细胞移植的研究进展[J].肝胆胰外科杂志,2004,16(3):72-75.
[2]BuglianiM,LupiR,Del Guerra S,et al.An alternative and simple method
to consistently prepare viable isolated human islets for clin:caltransplantation.Transplant Proc2004;36:605-606.
[3]LembertN,WescheJ,PetersenP,etal.A real density measurement is a convenient
method for the determination of porcine islet equivalent without counting and sizing individual islets[J].CellTransplantation,2003(12):33-41.
作者简介
傅红兴(1979—),男,讲师,长期从事微囊化胰岛移植研究。