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摘要：研究花脸香蘑（Lepista sordida）菌丝平板培养最佳碳源、氮源和无机盐，得到优化配方。以花脸香蘑菌丝生长速度为指标，通过平板培养研究9种碳源、8种氮源及6种无机盐对花脸香蘑菌丝生长的影响，并用三元二次正交回归试验对花脸香蘑的培养基配方进行优化。结果表明，促进花脸香蘑菌丝生长的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为麸皮，最佳无机盐为MgSO4，培养7 d后菌丝生长速率分别为2.29、1.88、1.64 mm/d;优化后的培养基配方为：马铃薯20%、琼脂2%、蔗糖3.06%、麸皮0.45%、MgSO4 0.02%。培养基中添加蔗糖、麸皮和MgSO4可促进花脸香蘑菌丝生长，并得到优化后的培养配方，为下一步研究提供了基础。
关键词：花脸香蘑;碳源;氮源;无机盐;生长速度
中图分类号：S646.1 10.1 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2019）19-0113-05
收稿日期：2019-02-11
基金项目：湖南省自然科学基金（编号：2019JJ50330）;湖南省重点研发计划（编号：2018NK2025）。
作者简介：陆 欢（1989—），女，湖南怀化人，硕士，助理研究员，主要从事食药用菌保鲜与加工研究。E-mail：245450595@qq.com。
通信作者：徐 宁，博士，助理研究员，主要从事食药用菌保鲜与加工研究。E-mail：1050353232@qq.com。
花脸香蘑[Lepista sordida（Schumach.）Singer]又名紫晶品蘑、丁香蘑、花脸蘑、紫花脸香蘑等，属担子菌门（Basidiomycotina）伞菌纲（Agaricomycetes）伞菌亚纲（Agaricomycetidae）伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）[1]，主要分布于亚洲（我国）、欧洲等地，我国主要分布在贵州、云南、黑龙江、辽宁、河北、河南、甘肃、青海、四川、新疆、山西、内蒙古和福建等地[2-5]。花脸香蘑气味浓香，色泽宜人，味道鲜美，是一种药食两用的珍稀真菌，其蛋白质含量丰富，各种氨基酸比较齐全[6-8]，特别是钙、铁、胡萝卜素和烟酸含量丰富，还含有较多的微量元素如铜、锌、氟、碘等[9]，具有养血、益神、补肝和利五脏的功效，还含有多糖[10-14]、二萜[15]、抑菌物质[16-19]等生物活性成分，是香蘑属中具有很高开发价值的优良食用菌之一。
国内外学者对花脸香蘑研究已有几十年，但到目前为止，花脸香蘑人工栽培还处于小规模阶段，还无法大规模生产。目前关于花脸香蘑生物学特性和营养特性已有报道，但关于碳源、氮源和无机盐对菌丝生长速度的影响报道极少[20-23]。本研究探讨了不同碳源、氮源和无机盐对花脸香蘑菌丝生长速度的影响及菌丝生长最佳碳源、氮源和无机盐，还对培养基配方进行了优化，为花脸香蘑的进一步研究提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株
花脸香蘑菌株为湖南省食用菌研究所保藏菌株。
1.1.2 主要试剂和仪器
所有试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，马铃薯、玉米粉、大豆粉和麸皮购自周边市场。试管、培养皿等玻璃仪器，购自泰州科健医疗用品有限公司;YXQ0LS-75SⅡ立式蒸汽灭菌锅，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-2F净化工作台，购自苏州净化设备有限公司;101-3AB电热鼓风干燥箱，购自天津市泰斯特仪器有限公司;智能生化培养箱，购自台湾斯特仪器设备有限公司。
1.1.3 培养基
基础培养基（1 L）：马铃薯200 g，琼脂20 g。碳源试验培养基：在基础培养基中分别添加葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、甲基纤维素，添加量均为总量的2%。氮源试验培养基：在基础培养基中分别添加硝酸钾、硝酸铵、尿素、蛋白胨、麦芽浸粉、玉米粉、大豆粉、麸皮，添加量均为总量的0.5%。无机盐试验培养基：在基础培养基中分别添加FeSO4、CuSO4、CaSO4、ZnSO4、MgSO4、NaCl，添加量均为总量的0.05%。
1.2 试验方法
1.2.1 不同营养条件对花脸香蘑菌丝生长的影响
将活化的花脸香蘑菌种于PDA培养基上25 ℃培养7 d，用打孔机取活化菌种块（菌块直径5 mm）接于添加不同碳源、氮源和无机盐平板（平板直径9 cm）中，于25 ℃培养5～7 d，用“十”字交叉法测定菌丝生长速度，观察菌丝长势，選择最合适碳源、氮源和无机盐，每个处理5次重复。
1.2.2 不同营养浓度对花脸香蘑菌丝生长的影响
将活化的花脸香蘑菌块（菌块直径5 mm）分别接种于不同浓度的最适碳源、氮源和无机盐的培养基中，碳源浓度（C）分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%，氮源浓度（N）分别为0.1%、0.2%、03%、0.4%、0.5%、0.6%，无机盐浓度（I）分别为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%，其他同“1.2.1”节。
1.2.3 花脸香蘑培养基优化
在“1.2.1”和“1.2.2”节试验基础上，对花脸香蘑培养基进行优化，即以马铃薯20%、琼脂2%为基础添加上述试验得到的最适碳源、氮源和无机盐，采用三元二次正交回归设计对这3个因素进行组合研究，建立碳源、氮源、无机盐与花脸香蘑菌丝生长速度之间的二次多项式回归方程，寻找最优的配方。试验因素水平及编码见表1。
以花脸香蘑菌丝生长速度为响应值Y，拟合二次多项式方程
式中：Y为菌丝生长速度的预测值;b0为常数项;bj为一次项系数;bhj为交互项系数;bjj为二次项系数;多项式方程（1）的拟合性质由确定系数R2检验，其统计学上的显著性由F值检验。 1.3 数据分析
试验数据采用DPS 9.50数据处理软件进行曲线拟合及统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同营养条件对花脸香蘑菌丝生长的影响
2.1.1 不同碳源对花脸香蘑菌丝生长的影响
由表2可知，花脸香蘑菌丝生长速度和长势在9种不同碳源培养基上表现有差异。在0.05水平上，以蔗糖为碳源生长最快，日均生长2.29 mm;其次为淀粉和麦芽糖，日均生长分别为2.06、1.95 mm;再次是甘露糖、甲基纤维素、白糖、葡萄糖、半乳糖;果糖最慢，日均生长仅为0.97 mm，说明蔗糖与其他8种碳源培养基之间存在显著差异。从菌丝长势上来看，以蔗糖、半乳糖、白糖和葡萄糖为碳源的培养基上的菌丝生长得更浓密壮实，菌丝颜色呈浅紫色。综合生长速度和菌丝长势，花脸香蘑菌丝生长的最佳碳源是蔗糖，说明花脸香蘑更容易吸收利用双糖。
2.1.2 不同氮源对花脸香蘑菌丝生长的影响
由表3可知，花脸香蘑菌丝生长速度和长势在8种不同氮源培养基上表现有差异。在0.05水平上，以麸皮为氮源生长最快，日均生长1.88 mm;其次为蛋白胨和麦芽浸粉，日均生长分别为1.65、1.56 mm;再次是玉米粉、大豆粉、KNO3、尿素;NH3Cl最慢，菌丝未生长，说明麸皮与其他7种氮源培养基之间存在显著差异。从菌丝长势上来看，菌丝颜色呈浅紫色，除尿素和NH3Cl为氮源的培养基之外，其余6种培养基的菌丝生长得较浓密。综合生长速度和菌丝长势，花脸香蘑菌丝生长的最佳氮源是麸皮。
2.1.3 不同无机盐对花脸香蘑菌丝生长的影响
由表4可知，花脸香蘑菌丝生长速度和长势在6种不同无机盐培养基上表现有差异。在0.05水平上，以MgSO4为无机盐生长最快，日均生长1.64 mm;其次为NaCl和CaSO4，日均生长分别为1.58、1.42 mm;再次是FeSO4、ZnSO4;CuSO4最慢，日均生长仅为0.81 mm，说明MgSO4与其他5种无机盐培养基之间存在差异。从菌丝长势上来看，菌丝颜色呈浅紫色，除CuSO4为无机盐培养基之外，其余5种培养基的菌丝生长得较浓密。综合生长速度和菌丝长势，花脸香蘑菌丝生长的最佳无机盐是MgSO4。
2.2 不同营养浓度对花脸香蘑菌丝生长的影响
2.2.1 不同碳源浓度对花脸香蘑菌丝生长的影响
对菌丝生长速度（YC）与碳源浓度（C）2个变量进行回归分析，得到方程：
式中：R2=0.706，F=623.859，P=0.030<0.05，说明模型与实测值拟合较好，菌丝生长速度与碳源浓度达到显著相关水平。由回归方程（2）预测值和试验实测值得到的结果如图1所示，结果表明，在碳源浓度为1%～3%之间，菌丝生长速度随着浓度增加而加快;浓度>3%后菌丝生长速度随着浓度增加而减慢。
2.2.2 不同氮源浓度对花脸香蘑菌丝生长的影响
对菌丝生长速度（YN）与碳源浓度（N）2个变量进行回归分析，得到方程：
式中：R2=0.988，F=2 769.159，P=0.014<0.05，说明模型与实测值拟合较好， 菌丝生长速度与氮源浓度达到显著相关
水平。由回归方程（3）预测值和试验实测值得到的结果如图2所示，结果表明，在氮源浓度为0.1%～0.5%之间，菌丝生长速度随着浓度增加而加快;當氮源浓度
关键词：花脸香蘑;碳源;氮源;无机盐;生长速度
中图分类号：S646.1 10.1 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2019）19-0113-05
收稿日期：2019-02-11
基金项目：湖南省自然科学基金（编号：2019JJ50330）;湖南省重点研发计划（编号：2018NK2025）。
作者简介：陆 欢（1989—），女，湖南怀化人，硕士，助理研究员，主要从事食药用菌保鲜与加工研究。E-mail：245450595@qq.com。
通信作者：徐 宁，博士，助理研究员，主要从事食药用菌保鲜与加工研究。E-mail：1050353232@qq.com。
花脸香蘑[Lepista sordida（Schumach.）Singer]又名紫晶品蘑、丁香蘑、花脸蘑、紫花脸香蘑等，属担子菌门（Basidiomycotina）伞菌纲（Agaricomycetes）伞菌亚纲（Agaricomycetidae）伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）[1]，主要分布于亚洲（我国）、欧洲等地，我国主要分布在贵州、云南、黑龙江、辽宁、河北、河南、甘肃、青海、四川、新疆、山西、内蒙古和福建等地[2-5]。花脸香蘑气味浓香，色泽宜人，味道鲜美，是一种药食两用的珍稀真菌，其蛋白质含量丰富，各种氨基酸比较齐全[6-8]，特别是钙、铁、胡萝卜素和烟酸含量丰富，还含有较多的微量元素如铜、锌、氟、碘等[9]，具有养血、益神、补肝和利五脏的功效，还含有多糖[10-14]、二萜[15]、抑菌物质[16-19]等生物活性成分，是香蘑属中具有很高开发价值的优良食用菌之一。
国内外学者对花脸香蘑研究已有几十年，但到目前为止，花脸香蘑人工栽培还处于小规模阶段，还无法大规模生产。目前关于花脸香蘑生物学特性和营养特性已有报道，但关于碳源、氮源和无机盐对菌丝生长速度的影响报道极少[20-23]。本研究探讨了不同碳源、氮源和无机盐对花脸香蘑菌丝生长速度的影响及菌丝生长最佳碳源、氮源和无机盐，还对培养基配方进行了优化，为花脸香蘑的进一步研究提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株
花脸香蘑菌株为湖南省食用菌研究所保藏菌株。
1.1.2 主要试剂和仪器
所有试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，马铃薯、玉米粉、大豆粉和麸皮购自周边市场。试管、培养皿等玻璃仪器，购自泰州科健医疗用品有限公司;YXQ0LS-75SⅡ立式蒸汽灭菌锅，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-2F净化工作台，购自苏州净化设备有限公司;101-3AB电热鼓风干燥箱，购自天津市泰斯特仪器有限公司;智能生化培养箱，购自台湾斯特仪器设备有限公司。
1.1.3 培养基
基础培养基（1 L）：马铃薯200 g，琼脂20 g。碳源试验培养基：在基础培养基中分别添加葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、甲基纤维素，添加量均为总量的2%。氮源试验培养基：在基础培养基中分别添加硝酸钾、硝酸铵、尿素、蛋白胨、麦芽浸粉、玉米粉、大豆粉、麸皮，添加量均为总量的0.5%。无机盐试验培养基：在基础培养基中分别添加FeSO4、CuSO4、CaSO4、ZnSO4、MgSO4、NaCl，添加量均为总量的0.05%。
1.2 试验方法
1.2.1 不同营养条件对花脸香蘑菌丝生长的影响
将活化的花脸香蘑菌种于PDA培养基上25 ℃培养7 d，用打孔机取活化菌种块（菌块直径5 mm）接于添加不同碳源、氮源和无机盐平板（平板直径9 cm）中，于25 ℃培养5～7 d，用“十”字交叉法测定菌丝生长速度，观察菌丝长势，選择最合适碳源、氮源和无机盐，每个处理5次重复。
1.2.2 不同营养浓度对花脸香蘑菌丝生长的影响
将活化的花脸香蘑菌块（菌块直径5 mm）分别接种于不同浓度的最适碳源、氮源和无机盐的培养基中，碳源浓度（C）分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%，氮源浓度（N）分别为0.1%、0.2%、03%、0.4%、0.5%、0.6%，无机盐浓度（I）分别为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%，其他同“1.2.1”节。
1.2.3 花脸香蘑培养基优化
在“1.2.1”和“1.2.2”节试验基础上，对花脸香蘑培养基进行优化，即以马铃薯20%、琼脂2%为基础添加上述试验得到的最适碳源、氮源和无机盐，采用三元二次正交回归设计对这3个因素进行组合研究，建立碳源、氮源、无机盐与花脸香蘑菌丝生长速度之间的二次多项式回归方程，寻找最优的配方。试验因素水平及编码见表1。
以花脸香蘑菌丝生长速度为响应值Y，拟合二次多项式方程
式中：Y为菌丝生长速度的预测值;b0为常数项;bj为一次项系数;bhj为交互项系数;bjj为二次项系数;多项式方程（1）的拟合性质由确定系数R2检验，其统计学上的显著性由F值检验。 1.3 数据分析
试验数据采用DPS 9.50数据处理软件进行曲线拟合及统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同营养条件对花脸香蘑菌丝生长的影响
2.1.1 不同碳源对花脸香蘑菌丝生长的影响
由表2可知，花脸香蘑菌丝生长速度和长势在9种不同碳源培养基上表现有差异。在0.05水平上，以蔗糖为碳源生长最快，日均生长2.29 mm;其次为淀粉和麦芽糖，日均生长分别为2.06、1.95 mm;再次是甘露糖、甲基纤维素、白糖、葡萄糖、半乳糖;果糖最慢，日均生长仅为0.97 mm，说明蔗糖与其他8种碳源培养基之间存在显著差异。从菌丝长势上来看，以蔗糖、半乳糖、白糖和葡萄糖为碳源的培养基上的菌丝生长得更浓密壮实，菌丝颜色呈浅紫色。综合生长速度和菌丝长势，花脸香蘑菌丝生长的最佳碳源是蔗糖，说明花脸香蘑更容易吸收利用双糖。
2.1.2 不同氮源对花脸香蘑菌丝生长的影响
由表3可知，花脸香蘑菌丝生长速度和长势在8种不同氮源培养基上表现有差异。在0.05水平上，以麸皮为氮源生长最快，日均生长1.88 mm;其次为蛋白胨和麦芽浸粉，日均生长分别为1.65、1.56 mm;再次是玉米粉、大豆粉、KNO3、尿素;NH3Cl最慢，菌丝未生长，说明麸皮与其他7种氮源培养基之间存在显著差异。从菌丝长势上来看，菌丝颜色呈浅紫色，除尿素和NH3Cl为氮源的培养基之外，其余6种培养基的菌丝生长得较浓密。综合生长速度和菌丝长势，花脸香蘑菌丝生长的最佳氮源是麸皮。
2.1.3 不同无机盐对花脸香蘑菌丝生长的影响
由表4可知，花脸香蘑菌丝生长速度和长势在6种不同无机盐培养基上表现有差异。在0.05水平上，以MgSO4为无机盐生长最快，日均生长1.64 mm;其次为NaCl和CaSO4，日均生长分别为1.58、1.42 mm;再次是FeSO4、ZnSO4;CuSO4最慢，日均生长仅为0.81 mm，说明MgSO4与其他5种无机盐培养基之间存在差异。从菌丝长势上来看，菌丝颜色呈浅紫色，除CuSO4为无机盐培养基之外，其余5种培养基的菌丝生长得较浓密。综合生长速度和菌丝长势，花脸香蘑菌丝生长的最佳无机盐是MgSO4。
2.2 不同营养浓度对花脸香蘑菌丝生长的影响
2.2.1 不同碳源浓度对花脸香蘑菌丝生长的影响
对菌丝生长速度（YC）与碳源浓度（C）2个变量进行回归分析，得到方程：
式中：R2=0.706，F=623.859，P=0.030<0.05，说明模型与实测值拟合较好，菌丝生长速度与碳源浓度达到显著相关水平。由回归方程（2）预测值和试验实测值得到的结果如图1所示，结果表明，在碳源浓度为1%～3%之间，菌丝生长速度随着浓度增加而加快;浓度>3%后菌丝生长速度随着浓度增加而减慢。
2.2.2 不同氮源浓度对花脸香蘑菌丝生长的影响
对菌丝生长速度（YN）与碳源浓度（N）2个变量进行回归分析，得到方程：
式中：R2=0.988，F=2 769.159，P=0.014<0.05，说明模型与实测值拟合较好， 菌丝生长速度与氮源浓度达到显著相关
水平。由回归方程（3）预测值和试验实测值得到的结果如图2所示，结果表明，在氮源浓度为0.1%～0.5%之间，菌丝生长速度随着浓度增加而加快;當氮源浓度